第一章紫杉醇对新西兰大白兔髂动脉球囊损伤后新生内膜形成和Cat K表达的影响背景经皮腔内冠状动脉血管成形术(PTCA)是冠心病治疗的一种重要方法,但是大约20%-40%的患者在术后6个月出现血管内再狭窄。新生内膜形成在血管成形术后再狭窄的发生中起着重要作用。组织蛋白酶K能降解细胞外基质,促进VSMC和EC迁移,与内膜增生密切相关。紫杉醇可抑制VSMC和EC的增殖及迁移,能防治支架内再狭窄。紫杉醇是否通过抑制组织蛋白酶K表达来减少新生内膜形成目前不是很清楚。目的观察紫杉醇对兔髂动脉球囊损伤后新生内膜形成和Cat K及NF-KB表达的影响,探讨紫杉醇减轻血管球囊损伤后新生内膜形成的机制。方法40只雄性新西兰大白兔,随机分为正常对照组(n=8)、手术组(n=16)和紫杉醇组(n=16),均予普通饮食。手术组和紫杉醇组行右侧髂动脉球囊损伤,紫杉醇组术后在喂食普通饲料的基础上予腹腔注射紫杉醇2mg/kg,持续7天或14天。对照组和手术组每日均腹腔注射相同体积的生理盐水。各组分别在术前1天,术后1天,术后第7天和第28天处死兔子时采血。用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清TNF-a变化。动物喂养在术后第7天和第28天处死兔子,取右侧髂动脉行病理形态学检测,用RT-PCR、Western-blotting和免疫组化方法测定血管中Cat K的表达,用Western-blotting和免疫组化方法检测NF-KB表达。结果1.术前三组血清TNF-a水平无明显差异。手术组术后第1天、第7天和第28天血清TNF-a水平分别为17.92±3.71,23.65±4.51和19.73±3.83ng/l,较术前12.97±2.24 ng/l明显升高,P<0.01。但同一时间点紫杉醇组与手术组TNF-a水平差别不是很明显,术后第7天TNF-a浓度最高。2.与正常对照组相比,手术组和紫杉醇组内膜面积和内膜/中膜面积(I/M)明显增加；手术组术后7天,28天内膜面积和内膜与中膜面积比分别为0.19±0.05mm2,0.35±0.11和0.69±0.1lmm2,1.39±0.13,两者相比,P<0.01。随着术后时间的延长,手术组和紫杉醇组内膜面积和内膜/中膜面积(I/M)明显增加,紫杉醇组内膜面积和内膜/中膜面积(I/M)比手术组同一时间点减少,三组中膜面积在这两个时间点无显著性差异,P>0.05。3.正常对照组基本无Cat K mRNA表达,手术组Cat K mRNA和紫杉醇组Cat K mRNA明显增加,紫杉醇组术后7天,28天Cat K mRNA表达分别为0.559±0.055和0.786±0.025,两者相比,P<0.01。且随着术后时间延长,Cat K mRNA表达增加,与紫杉醇组(0.786±0.025)相比,同一时间点手术组Cat K mRNA表达(0.880±0.065)明显增多,P<0.05。4.正常对照组无明显Cat K蛋白的表达,手术组和紫杉醇组均有Cat K表达,手术组术后7天,28天Cat K表达分别为0.421±0.05和0.819±0.10,两者相比,P<0.01。且随着术后时间延长,Cat K表达增加,与手术组(0.819±0.10)相比,同一时间点紫杉醇组Cat K表达(0.632±0.06)低于同期的手术组,P<0.05。5.免疫组化分析,正常对照组无明显Cat K阳性蛋白的表达,手术组Cat K和紫杉醇组Cat K阳性表达明显增加,且随着术后时间延长,Cat K阳性表达增加,与手术组(16.13±1.27)相比,同一时间点紫杉醇组Cat K免疫组化评分(12.46±1.53)明显减少,P<0.05。6.正常对照组基本无明显NF-KB蛋白的表达,手术组NF-KB和紫杉醇组NF-KB明显增加,且随着术后时间延长,NF-KB表达增加,与手术组(0.369±0.04)相比,同一时间点紫杉醇组NF-KB表达(0.241±0.03)明显减少,P<0.05。7.免疫组化分析,正常对照组无明显NF-KB阳性蛋白的表达,手术组NF-KB和紫杉醇组NF-KB阳性表达明显增加,手术组第7天和28天免疫组化评分分别为4.75±0.79和14.29±1.36,两者相比,P<0.01。且随着术后时间延长,NF-KB阳性表达增加,与紫杉醇组免疫组化评分为(11.37±1.45),低于同一时间点手术组NF-KB免疫组化评分(14.29±1.36),P<0.05。结论新西兰大白兔髂动脉球囊损伤后新生内膜明显增厚,内膜Cat K和NF-KB表达均明显增加,且随着术后时间的延长增加越多。紫杉醇可能通过抑制NF-KB活性减少Cat K表达,减轻髂动脉球囊损伤后新生内膜形成。血清TNF-a水平在兔髂动脉球囊损伤后升高,与在兔血管壁中Cat K表达可能无直接关系。第二章TNF-a对人脐静脉内皮细胞中Cat K表达的影响及其信号通道机制背景肿瘤坏死因子-a(TNF-a)是一种重要的促炎症因子,可以调控多种炎症因子和生长因子的表达。TNF-a在血管球囊损伤后的新生内膜中表达增加。血管损伤时导致多种炎症因子和细胞因子被激活,这些因子相互作用加重了血管壁的炎症反应,促进了新生内膜的形成。组织蛋白酶K能降解细胞外基质,促进VSMC和EC迁移,与内膜增生密切相关。TNF-a可以促进血管内皮细胞中Cat K的表达,但是两者之间的时效和量效关系尚不十分清楚。在人的内皮细胞中TNF-a通过哪些信号通道促进Cat K的表达,也不是很清楚。目的观察TNF-a不同浓度和不同作用时间对人脐静脉内皮细胞中CatK表达的影响,以及不同信号通道阻滞剂对TNF-a引起Cat K表达的抑制作用,探讨TNF-a影响Cat K表达的机制。方法采用HUVEC细胞株传代3-6代时处于对数生长期的细胞作为研究对象。细胞中加入不同浓度的TNF-a作用24h或者加入10ng/ml的TNF-a作用不同时间。在HUVEC中加入10ng/ml的TNF-a,并分别加入特异性的P38MAPK信号通道阻滞剂SB203580、PI3K信号通道阻滞剂LY294002和NF-kB通道阻滞剂PDTC作用24h。用RT-PCR方法和western-blotting方法检测细胞中的Cat K mRNA和蛋白的表达。结果1.正常对照组HUVEC未见明显Cat K mRNA表达。随着TNF-a浓度的增加,Cat K mRNA的表达越来越强,0.1ng/ml,1ng/ml和lOng/ml TNF-a组Cat K mRNA表达分别为0.27±0.03,0.39±0.04和0.50±0.04,两两相比,均P<0.01。1Ong/mlTNF-a组Cat K mRNA表达最强,1OOng/mlTNF-a组Cat K mRNA表达为0.44±0.06,较1Ong/mlTNF-a组反而下降,P<0.05。2.随着TNF-a浓度的增加,Cat K的表达越来越强,0.1ng/ml,1ng/ml和lOng/ml TNF-a组Cat K表达分别为1.12±0.13,1.55±0.11和1.94±0.10,两两相比,均P<0.05。1Ong/mlTNF-a组Cat K表达最强,l00ng/mlTNF-a组Cat K表达(1.36±0.56)较1Ong/mlTNF-a组表达减少,P<0.05。3.予lOng/ml TNF-a作用不同时间后,HUVEC可见Cat K mRNA明显表达,TNF-a干预时间6h,12h和24h时Cat K mRNA表达分别为0.37±0.04,0.59±0.06和0.69±0.04,两两相比,均P<0.01。从6h到24h时,随着TNF-a干预时间的增加,Cat K mRNA的表达越来越强。Cat K mRNA表达在TNF-a24h组最强,TNF-a48h组Cat K mRNA表达(0.61±0.07)较TNF-a24h组明显下降,P<0.05。4. TNF-a干预时间6h,12h和24h时Cat K表达分别为0.36±0.04,0.54±0.05和0.84±0.07,两两相比,均P<0.05,予lOng/ml TNF-a作用从6h到24h时,随着TNF-a干预时间的增加,Cat K的表达越来越强。TNF-a48h组Cat K表达为0.60±0.07,较TNF-a24h组明显减少,P<0.05。5. HUVEC在lOng/ml TNF-a刺激基础上分别加入SB203580、LY294002和PDTC作用24h后,细胞中Cat K mRNA表达分别为0.55±0.04,0.57±0.01和0.52±0.04,较lOng/ml TNF-a组(0.65±0.04)时均明显下降,P<0.05。6. HUVEC在10ng/mlTNF-a刺激基础上分别加入SB203580、LY294002和PDTC作用24h后,细胞中Cat K表达为0.70±0.08,0.67±0.11和0.62±0.09,较10ng/mlTNF-a组(0.91±0.15)时均明显下降,P<0.01。结论TNF-a可以呈剂量和时间依赖性刺激HUVEC中Cat K表达：TNF-a可能通过激活P38、PI3K和转录因子NF-KB信号通路促进HUVEC中Cat K表达。第三章紫杉醇对TNF-a诱导人脐静脉内皮细胞中Cat K表达的影响背景完整内膜在防止血栓形成和再狭窄发生中起重要作用,延迟血栓形成和延迟再狭窄发生可能与紫杉醇抑制内皮再生有关。组织蛋白酶K能降解ECM的多种成分,促进VSMC和EC迁移,与内膜增生密切相关。NF-kB是一个重要的转录因子,可以调控多种基因产物的表达。紫杉醇有明显抑制细胞迁移的作用,紫杉醇对组织蛋白酶K表达的影响目前尚无研究。紫杉醇能否通过抑制内皮细胞中NF-kB表达来减少Cat K表达,目前尚不清楚。目的观察紫杉醇对TNF-a诱导人脐静脉内皮细胞中Cat K及NF-kB表达的影响,探讨紫杉醇在防治内膜增生的作用机制。方法采用HUVEC细胞株传代3-6代时处于对数生长期的细胞作为研究对象。用10ng/mlTNF-a刺激人脐静脉内皮细胞中的Cat K的表达,并分别加入不同浓度的紫杉醇干预24小时,用RT-PCR方法检测细胞中Cat K mRNA的表达；用western-blotting方法检测细胞中的CatK和NF-kB蛋白的表达。结果1.1nmol/l,10nmol/l,100nmol/l和1μml/l紫杉醇干预组Cat K mRNA的表达分别为0.85±0.06,0.68±0.04,0.59±0.02和0.49±0.03,两两相比,均P<0.05,均较TNF-a组(1.02±0.07)表达减少,均P<0.05。紫杉醇可以呈剂量依赖性地抑制TNF-a所致的HUVEC中Cat K mRNA的表达,紫杉醇浓度越高,抑制Cat K mRNA的表达越强。2.1nmol/l紫杉醇组和TNF-a组中Cat K表达分别为1.08±0.07和0.87±0.03,两者相比,P<0.05。紫杉醇可以呈剂量依赖性地抑制TNF-a所致的HUVEC中Cat K蛋白的表达,紫杉醇浓度越高,细胞中CatK的表达越少。3.正常对照组未见明显NF-kB的表达,1nmol/l紫杉醇组和TNF-a组中NF-kB表达分别为0.93±0.04和0.87±0.07,两者相比,P<0.05。紫杉醇可以呈剂量依赖性地抑制TNF-a所致的HUVEC中NF-kB蛋白的表达。紫杉醇浓度越高,细胞中NF-kB的表达越少。结论紫杉醇可以呈剂量依赖性地抑制TNF-a所致的HUVEC中Cat K和NF-kB的表达,紫杉醇可能通过抑制NF-kB活性使Cat K表达减少。