背景黑素瘤是源自黑素细胞的恶性肿瘤,虽然其发生率仅占皮肤肿瘤病例的5%左右,但因其增殖快、易转移、易复发等特点,具有很高的致死率,居皮肤肿瘤致死原因的首位(占所有死亡病例的75%)。黑素瘤在我国每年的新发病例约2万例,并且其发病率正在快速增长。然而,黑素瘤的诊断和治疗目前仍面临着许多挑战:黑素瘤发病因素十分复杂,多种诱因导致的基因突变及信号通路异常都参与其中,因此明确特异而关键的致病分子事件相当困难;在现有治疗方案中,癌基因靶向药物在治疗初期获得了良好的反应率,给BRAF突变型的黑素瘤病例带来新的曙光,但绝大多数病例均无可避免地出现治疗抵抗,因此,如何克服癌基因靶向治疗抵抗是目前黑素瘤临床治疗的一个难题。据统计,42%的黑素瘤源于黑素细胞良性皮损,如黑素细胞痣。黑素瘤发病学说中经典的“细胞衰老逃逸”理论认为:癌基因突变(如BRAFV600E及NRASQ61R)首先引起黑素细胞的短暂增殖,但在正常情况下,抑癌通路p53/p21或p16/p RB出现反应性激活,通过阻滞细胞周期进程,将细胞诱导至稳定的衰老状态,形成黑素细胞痣;但在少数情况下,个别获得了额外的基因突变或表观遗传学改变的细胞克隆,可以克服抑癌通路的调控,逃逸细胞衰老屏障的限制,发生恶性转化,进而发展为黑素瘤,但目前引起衰老逃逸的分子事件尚未完全明确。在发展为黑素瘤的细胞中,癌基因BRAF的活性突变是目前已知发生率最高的致癌突变,可引起下游MAPK等信号通路的持续激活,增强黑素瘤细胞的增殖和侵袭能力,并参与抗凋亡及促进肿瘤血管生成等恶性行为。因此,靶向BRAF的抑制剂成为治疗BRAF突变型黑素瘤病例的理想方法,的确,在临床应用的初期,BRAF靶向抑制剂威罗菲尼产生了良好的效果,治疗总反应率达到了53%,但在数月的治疗“蜜月期”过后,几乎所有病例的治疗反应率都出现下降,逐渐形成对威罗菲尼的治疗抵抗,继而出现黑素瘤复发和转移,导致治疗失败并造成病人死亡。因此,威罗菲尼的治疗抵抗是目前黑素瘤临床治疗的一个难题。近年来,NOTCH通路在黑素瘤中的异常活化及其功能受到广泛关注。NOTCH通路受体NOTCH1、NOTCH2以及主要配体Jagged1、Jagged2、DLL1在黑素瘤中的表达明显高于黑素细胞痣;激活NOTCH1信号引起正常人黑素细胞出现类似黑素瘤细胞的恶性表型。这些结果都提示NOTCH通路在黑素瘤发生发展中的作用重要且复杂,因此,对其深入的探索十分必要。新近研究发现,活化的NOTCH通路可以通过增加靶基因HES1的转录阻滞成纤维细胞的细胞衰老进程,促进细胞衰老逃逸的发生。然而,在黑素瘤的发生发展过程中,NOTCH通路对细胞衰老的调控作用仍知之甚少。因此,全面了解NOTCH通路在黑素细胞恶变过程的关键步骤之一——衰老逃逸中的作用具有重要意义。此外,新近研究还发现,在多种类型肿瘤的化疗药物抵抗中,NOTCH信号通路也有不同程度的参与。其中,在黑素瘤细胞中过表达NOTCH1分子活性片段引起细胞对BRAF抑制剂威罗菲尼的GI50值出现明显上升,提示NOTCH信号通路的活化可以引起黑素瘤细胞产生针对BRAF抑制剂的治疗抵抗。因此,探索NOTCH通路在黑素瘤靶向治疗中的作用十分重要,可能对黑素瘤治疗提供新的策略。综上所述,NOTCH信号通路是黑素瘤中重要的促癌通路,通过抑制该通路活性来治疗黑素瘤是一个新颖且具有良好前景的策略,结合近年来的相关研究结果,我们认为NOTCH信号通路在黑素细胞衰老逃逸和黑素瘤的BRAF抑制剂治疗抵抗中起着十分关键的作用,并且可能是二者紧密联系的重要机制之一。本项目拟通对研究NOTCH通路对癌基因诱导黑素细胞衰老的影响及NOTCH通路抑制剂联合BRAF抑制剂在黑素瘤治疗中的效果,以期了解NOTCH通路在黑素细胞恶性转化中的作用,丰富和完善黑素瘤发病机制,并为黑素瘤的治疗探索新思路。研究目的1.研究活化的NOTCH信号对癌基因诱导的黑素细胞衰老的影响。2.分析NOTCH通路抑制剂对黑素瘤细胞衰老的影响及其机制。3.探索NOTCH通路抑制剂联合BRAF抑制剂在黑素瘤治疗中的应用效果及其机制。研究方法1.利用免疫组化染色在黑素瘤和黑素细胞痣皮损切片中检测活性NOTCH1表达;利用Western blot和Real-time PCR技术在黑素瘤细胞系和正常人黑素细胞中检测活性NOTCH1分子及下游靶基因表达,明确NOTCH1信号在黑素细胞良恶性皮损中的活化差异。2.利用慢病毒载体转染正常人黑素细胞,建立NOTCH1 intracellular domain(N1ICD)过表达的稳转细胞研究体系,观察活化的NOTCH1信号对正常人黑素细胞生物学行为的影响。同时通过转染共表达癌基因BRAFV600E、NRASQ61R,观察活化的NOTCH1对癌基因诱导细胞衰老的影响。3.筛选高表达NOTCH1的人黑素瘤细胞系,利用NOTCH通路阻断剂——γ-分泌酶抑制剂DAPT处理后,观察黑素瘤细胞的衰老表型。4.利用携带BRAFV600突变的黑素瘤细胞系,联合应用BRAF抑制剂威罗菲尼及NOTCH抑制剂DAPT进行临床前期实验,对比联合疗法与单药治疗的效果,观察黑素瘤细胞耐药性的差异,并探讨相关作用机制。5.利用慢病毒载体转染携带BRAFV600突变的黑素瘤细胞,建立过表达N1ICD的稳转细胞系,观察活化的NOTCH1对威罗菲尼治疗抵抗的影响及对DAPT联合治疗的反应。主要研究结果1.NOTCH通路活性在黑素瘤皮损和细胞系中显著增高:免疫组化结果表明活化的NOTCH1分子在黑素细胞痣中不表达,而在黑素瘤切片中高表达;Western blot和Real-time PCR结果提示:相比于正常人黑素细胞,NOTCH通路活性在黑素瘤细胞系中明显增强2.活性NOTCH1过表达可以阻止癌基因诱导的黑素细胞衰老:经慢病毒转染NOTCH1活性片段后,正常人黑素细胞出现了恶性转化;同时共表达癌基因BRAFV600E、NRASQ61R后,正常人黑素细胞出现衰老表型,而过表达NOTCH1活性片段的细胞则未出现衰老表型。3.NOTCH抑制剂诱导黑素瘤细胞衰老:经NOTCH抑制剂DAPT处理后黑素瘤细胞生长受到抑制并出现了衰老表型。4.NOTCH抑制剂与BRAF抑制剂对黑素瘤生长有协同抑制作用:DAPT与威罗菲尼对黑素瘤细胞生长产生协同抑制作用,并可明显抑制黑素瘤细胞对BRAF抑制剂产生的治疗抵抗。5.机制探讨及靶分子的确定:细胞凋亡及衰老表型检测提示DAPT对威罗菲尼的协同抑制作用主要依赖于对细胞衰老而非凋亡的诱导;Western blot确定DAPT可以抑制CDK6蛋白的表达,并有效抑制RB蛋白磷酸化。结论通过本课题的研究,我们首次发现了在正常人黑素细胞中激活NOTCH信号可阻止癌基因诱导的细胞衰老,而在黑素瘤中,抑制NOTCH信号可以诱导细胞衰老;此外,本研究首次证实了NOTCH抑制剂联合BRAF抑制剂对携带BRAFV600突变的黑素瘤细胞具有协同抑制作用,可以明显延迟黑素瘤细胞对BRAF抑制剂的治疗抵抗。我们的发现进一步完善了NOTCH信号通路在黑素瘤中的促癌作用并对携带BRAFV600突变的黑素瘤治疗提供了新的策略。