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背景:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)位居全球第六大常见的肿瘤类型和第四大癌症相关死亡原因。HCC的临床诊疗实践已取得许多进展,但HCC患者的整体预后状况仍亟待改善。预后评估对于HCC患者的监测随访和治疗策略抉择非常重要。近年来,第二代测序技术的普及极大丰富了我们对癌症生物学的认识。通过基因组学大数据的生物信息学分析,并与HCC患者的临床病理特征相结合,进而鉴定和开发新颖可靠的预后预测模型有着广阔的应用前景。代谢异常是包括肝癌在内众多恶性肿瘤的标志性特征之一。过氧化物酶体是一种单层膜细胞器,内含众多代谢酶类,直接参与多条代谢途径。在HCC和其它多个肿瘤类型中,已报道多种过氧化物酶体酶及其活性发生改变,且相应的酶抑制剂或改变基因表达水平可抑制或促进肿瘤的生长,表明过氧化物酶体参与多种肿瘤的发生发展过程。目前,关于过氧化物酶体在肝癌中的研究主要集中于某些过氧化物酶体基因,少有研究从亚细胞水平探讨过氧化物酶体整体在肝癌中的预后评估价值。羟基酸氧化酶HAO2是过氧化物酶体中主要催化含羟基脂肪酸氧化生成酮酸和过氧化氢的酶。我们前期通过对公共数据库中肝癌及其癌旁组织的转录组学数据分析发现,HAO2在人体肝癌组织中表达明显下降,而且HAO2的低表达与肝癌更差的预后有关。目前有关HAO2的研究报道非常有限,有研究发现在药物诱导的肝癌动物模型及人体肝癌组织样本中HAO2的表达水平均明显下降,且过表达HAO2能够抑制移植瘤的生长,提示HAO2可能在肝癌发生发展中具有抑癌作用,但其涉及的分子机制尚未见报道。本研究利用生物信息学方法分析过氧化物酶体相关基因在肝癌预后评估中的整体价值;在同时具有预后意义和差异表达变化的过氧化物酶体相关基因中,重点关注差异表达变化最显著的基因HAO2,探讨其抑制肝癌的可能分子机制。方法:1.检索公共数据库中的肝癌基因组学数据集,选择纳入了2个肝癌数据集(n=547),并定义过氧化物酶体基因集;利用R语言及Bioconductor扩展包,采用生物信息学方法,对肝癌数据集的转录组学数据及临床信息进行预处理及后续分析;筛选具有预后价值的过氧化物酶体基因;分析预后相关的过氧化物酶体基因的差异表达情况;在TCGA肝癌数据集中从预后相关基因中应用LASSO算法筛选基因并建立预后模型;评估基因模型的预测效果及其独立性,并使用外部数据集验证;与其它肝癌基因预后模型对比,并联合临床特征优化预后模型。2.系统分析HAO2在大样本肝癌数据集中的表达变化情况及与肝癌预后的关系,采用临床标本验证HAO2的表达变化。采用GSEA分析探索HAO2可能相关的KEGG通路。采用慢病毒感染构建HAO2稳定过表达的肝癌细胞株,Western blot及qPCR验证过表达效果;CCK8及流式细胞仪检测过表达HAO2对肝癌细胞增殖及细胞周期的影响;WB方法检测HAO2对细胞周期关键蛋白的影响;通过对HAO2过表达细胞进行转录组测序,分析下游可能的主要分子及机制;体外实验验证推测的分子机制。结果:1.本研究共纳入2个HCC数据集的547例肝癌组织样本。其中训练集TCGA-LIHC包含351例,验证集LIRI-JP包含196例。定义了一个包含113个基因的过氧化物酶体基因集,预后分析发现47个过氧化物酶体基因与肝癌患者预后相关,部分基因同时表现出肝癌与癌旁组织的差异表达,多数为在肝癌中表达下降,其中HAO2为差异变化倍数最大的预后相关基因。从47个基因中采用LASSO算法选定10个最优的预后基因(ACAT1,AGPS,ATAD1,LDHA,MTARC2,PECR,ASCL6,MPV17,PRDX1,TRIM37)并建立了一个新的基于10个过氧化物酶体相关基因的肝癌预后模型。生存分析及ROC曲线、单因素及多因素Cox回归分析以及外部数据集验证表明该基因模型具有独立稳健的预测能力,与其它6个基因模型比较,该模型预测能力具有跨平台稳定性。结合肝癌患者的TNM分期优化了基因模型。GSEA分析表明该基因预测模型与过氧化物酶体的代谢功能密切相关。2.HAO2在2个独立的肝癌数据集(共869例肝癌及癌旁组织样本)中均为肝癌组织中表达明显下降,且HAO2的低表达与肝癌患者的不良预后相关。肝癌患者的免疫组化染色验证了HAO2在肝癌组织中表达下降。单基因GSEA分析提示HAO2的表达与细胞周期密切相关,发现HAO2的高表达可能与细胞周期抑制相关。成功采用慢病毒构建稳定过表达HAO2的肝癌细胞系,CCK8检测发现HAO2过表达抑制肝癌细胞增殖,流式细胞仪检测表明HAO2过表达可诱导细胞周期G1期阻滞,Western blot实验发现过表达HAO2能够上调p21表达、抑制CDK2、CDK6表达。转录组测序数据分析及验证实验表明HAO2可抑制ID1在肝癌细胞中的表达。在过表达HAO2的基础上过表达ID1能够回复HAO2对p21的上调作用,表明HAO2可能通过ID1-p21途径诱导细胞周期阻滞,从而抑制肝癌进展。结论:1.我们首次通过公共数据库中的肝癌数据集构建了一个基于10个过氧化物酶体相关基因的肝癌预后模型,评价分析表明该模型具有良好的预后预测价值,可能为肝癌患者的预后风险分层提供参考。2.大样本肝癌数据集中,HAO2在肝癌组织中较癌旁正常组织明显下降;HAO2可能通过ID1-p21途径诱导肝癌细胞周期阻滞,抑制肝癌进展。