藤黄酸逆转结肠癌细胞奥沙利铂耐药的铜离子转运机制研究

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[目的]探讨藤黄酸逆转人结肠癌奥沙利铂耐药细胞耐药性及其对hCTP1、ATP7A和ATP7B表达的影响的研究。  [方法]体外培养人结肠癌细胞亲本株(LoVo)、奥沙利铂耐药细胞株(LoVo/L-OHP)及藤黄酸逆转株(LoVo/L-OHP/GA)。采用不同浓度的奥沙利铂(0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0μmol/L)对上述三种细胞进行干预。CCK-8法检测奥沙利铂对三种细胞株的增殖抑制作用;流式细胞技术检测奥沙利铂对三种细胞株凋亡的影响;Transwell实验检测奥沙利铂对三种细胞株侵袭能力的影响;Western Blot技术检测三种细胞hCTP1、ATP7A及ATP7B蛋白的表达水平;QRT-PCR检测hCTP1、ATP7A及ATP7B mRNA表达水平;原子吸收法测定三种细胞中金属铂的含量以明确三种细胞株对奥沙利铂的贮存能力。  [结果]  1、通过药物浓度梯度法成功筛选人结肠癌奥沙利铂耐药细胞株LoVo/L-OHP及人结肠癌耐奥沙利铂细胞藤黄酸逆转株LoVo/L-OHP/GA。  2、奥沙利铂体外对人结肠癌LoVo、LoVo/L-OHP、LoVo/L-OHP/GA细胞株均有增殖抑制作用,抑制率与药物浓度成正相关;经奥沙利铂筛选后的奥沙利铂耐药株(LoVo/L-OHP)对奥沙利铂存在一定的抵抗能力;奥沙利铂耐药株经藤黄酸处理后(LoVo/L-OHP/GA)抵抗能力下降。  3、流式细胞技术提示经奥沙利铂筛选后的耐药株在奥沙利铂条件下抗凋亡能力明显提高,但经藤黄酸处理后抗凋亡能力得到逆转。  4、Transwell实验提示经奥沙利铂筛选后的耐药株在奥沙利铂条件下侵袭能力明显高于亲本株,但经藤黄酸处理后侵袭能力下降。  5、Western Blot法检测三种LoVo细胞后,hCTP1蛋白表达量:亲本株>逆转株>耐药株,耐药株与亲本株、逆转株比较差异存在统计学意义,亲本株与逆转株比较差异无统计学意义;ATP7A及ATP7B蛋白表达量耐药株>逆转株>亲本株,耐药株与亲本株、逆转株比较差异存在统计学意义,亲本株与逆转株比较差异无统计学意义。  6.QRT-PCR法检测三种LoVo细胞后,hCTP1 mRNA的表达量显示为亲本株>逆转株>耐药株,耐药株与亲本株、逆转株比较差异存在统计学意义,亲本株与逆转株比较差异无统计学意义;ATP7A及ATP7B mRNA的表达量显示为耐药株>逆转株>亲本株,耐药株与亲本株、逆转株比较差异存在统计学意义,亲本株与逆转株比较差异无统计学意义。  5、原子吸收实验显示:细胞内铂含量亲本株>逆转株>耐药株,实验表明藤黄酸能改善LoVo细胞对奥沙利铂的贮存能力。  [结论]藤黄酸能逆转人结肠癌奥沙利铂耐药株LoVo/L-OHP的耐药性,其机制可能与铜离子转运机制相关,是通过上调hCTP1、下调ATP7A及ATP7B实现的。
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