研究背景超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN通道)属于电压门控型离子通道超家族,具有独特的电生理功能。在哺乳动物体内,HCN通道共有4个亚型,HCN1-HCN4,不同亚型HCN通道广泛分布于心血管和神经系统并参与不同的生理过程。阐明胞内信号通路调控HCN通道的作用机制和新型抑制剂的发现对于解析通道功能和靶向HCN通道的药物开发具有重要的意义。磷脂酰肌醇4.5-二磷酸(PIP2)是最重要的膜磷脂之一,主要分布在胞膜上,其水平可被多种受体和胞内信号通道调节。近年研究表明,PIP2调节多类离子通道功能,本课题的研究内容之一为探索PIP2及其下游信号通路PI3K/PIP3是否调控HCN通道功能;此外,HCN通道在控制心脏和神经系统中的起搏活动中起关键作用,因此,HCN通道已成为开发治疗心绞痛,疼痛和癫痫药物的新靶点,本课题另一方面的研究内容是针对系列候选化合物进行筛选,旨在寻找作用更强,亚型选择性更优的新型HCN通道抑制剂。研究目的1)探究PIP2对HCN通道的调控作用。2)探究PIP2下游信号通路PI3K/PIP3对HCN通道功能的影响。3)系列新型HCN通道抑制剂的发现。研究方法1)将HCN通道和PI5K重组质粒共同转染到COS7细胞,探究胞内PIP2上调对HCN通道各亚型的调控作用。2)将HCN通道和M1受体重组质粒共同转染到COS7细胞,给予20 μM Oxo-M激活PLC信号通路,探究胞内PIP2下调对HCN通道各亚型的影响。3)构建稳定表达HCN4通道的HEK293细胞系,将PI3K转染至HCN4通道稳定细胞系中,探究胞内过表达PI3K对HCN4通道功能的调控。通过系列化合物的筛选,寻找HCN通道的新型抑制剂,并以其作为先导化合物进行结构修饰,以发现作用更强,亚型选择性更优的新型HCN通道抑制剂。实验结果1)过表达PI5K可以特异性调控HCN4通道。2)过表达M1受体激活PLC信号通路可增强HCN通道电流。3)胞内过表达PI3K,上调PIP3水平,可上调HCN4通道的功能。4)化合物4a可以抑制HCN通道电流,其中4e为抑制作用最强的改构体,尤其是对HCN2通道的抑制效应。5)化合物4e可以抑制小DRG神经元所产生的Ih电流,同时抑制其动作电位放电频率。结论我们的研究结果发现过表达胞内PI5K,上调胞内PIP2水平可以特异性调控HCN4通道功能,主要体现在影响HCN4通道的电压敏感性,电流大小及激活动力学方面。除了 PIP2,过表达胞内PI3K上调PIP3水平也可上调HCN4通道的功能,主要体现在增加其电流密度和减慢通道的开放速率。另一方面,本课题发现了系列具有新型结构骨架的HCN通道的抑制剂,其中化合物4e作用于HCN2通道的IC50低至3 μM,相比于HCN1和HCN4通道而言,具有一定HCN2通道亚型特异性。此外,4e可以抑制小DRG神经元介导的Ih电流和动作电位放电,具有潜在的治疗疼痛价值。