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人类免疫缺陷病毒(HIV)是引起艾滋病的病原体,分为两型:HIV-1和HIV-2,主要为HIV-1。它和一般的病毒有明显的差别,首先是其基因组相对复杂,编码更多的蛋白质来调控病毒潜伏、激活、转录与复制等过程,其次是它在宿主个体内变异迅速。鉴于HIV-1包膜糖蛋白gp120和gp41是HIV-1的主要抗原成分,是检测HIV抗体诊断试剂盒的重要组成成分,也是制备抗gp120和gp41单克隆抗体必需的免疫原,应用广泛,意义十分重大。本研究利用分子生物学手段,将gp120和gp41的编码基因分别重组到毕赤酵母及大肠杆菌的表达载体中,并成功地进行了蛋白表达。 外膜糖蛋白gp120的编码基因的克隆和在毕赤酵母中的表达。以质粒pHXB2-gp160为模板进行PCR,扩增出gp120抗原的全长DNA(gp120L)和短片段DNA(gp120S),构建了酵母表达载体pPICZ α A-gp120L和pPICZ α A-gp120S。将重组质粒线性化后转化到毕赤酵母GS115细胞株,使gp120基因同源重组整合到毕赤酵母的染色体上,经过选择培养基、PCR鉴定、Zeocin抗性筛选后,将得到的阳性菌株进行甲醇诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,结果表明gp120L基因没有得到表达,gp120S基因在酵母胞内有微量表达,表达产物为19 kD。 跨膜糖蛋白gp41短片段基因在大肠杆菌中的表达、纯化及初步应用。同样以pHXB2-gp160为模板进行PCR,扩增出gp41抗原短片段DNA,构建重组表达质粒pET32a-gp41S,转化大肠杆菌BL21(DE3)plys,用IPTG诱导表达,表达产物经过SDS-PAGE和Western blot分析证实35.5 kD的目的蛋白gp41S主要存在于包涵体中,凝胶扫描成像分析证实其表达量占菌体总蛋白的10%以上。包涵体经过洗涤、溶解和复性后,纯度可达90%以上,表明已获得高纯度的目的蛋白。用纯化的重组gp41蛋白作为包被抗原,应用间接ELISA法对4份HIV阳性血清中的gp41抗体进行检测,结果表明该纯化蛋白具有一定的抗原活性,能特异性地与HIV抗体反应。用该蛋白免疫小鼠,经过三次免疫后抗体效价可达