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饲料添加剂是指添加在动物日粮中能够丰富动物日粮营养成分、改善机体营养和健康水平及性能、提高动物性产品质量、缩减养殖成本的物质。中草药具有天然安全、资源丰富等优点,在动物生产中中草药作为饲料添加剂具有抗菌抗病毒、增强动物抗病力、改善机体生长发育的作用。自国家步入禁抗、无抗时期以来,中草药饲料添加剂及相关产品的研究和开发越来越受到行业关注。本课题通过细胞实验确定了几种中药对细胞生长的促进作用,后组成不同复方,从体外实验和体内实验分别验证不同中药复方对于机体生长发育、免疫增强方面的作用,最终确定了一种有效经济绿色的能够促进动物体重增加、提高动物免疫力的中药复方,并通过小鼠急性经口毒性实验验证中药复方为实际无毒产品。本课题的研究内容和研究结果如下。1中药复方的筛选和拟定本研究通过CCK-8细胞活力实验发现各中药对C2C12细胞的最佳作用时间为24h,在该时间下的最佳作用浓度分别为:白术1.95 mg/m L、党参7.80 mg/m L、当归3.91 mg/m L、甘草0.98 mg/m L、板蓝根7.80 mg/m L、黄芪7.80 mg/m L、山楂7.80mg/m L、女贞子7.80 mg/m L。后将几味中药在最佳作用时间和浓度下组成5种不同复方,探究中药复方分别从细胞实验和动物实验对于促进体重增长和提高免疫力的作用。5种复方组成分别为:复方1:黄芪、当归、党参、板蓝根、白术、甘草复方2:黄芪、山楂、白术、女贞子复方3:黄芪、山楂、当归、女贞子复方4:黄芪、山楂、当归复方5:黄芪、山楂2中药复方能促进C2C12细胞增殖本研究通过Edu细胞增殖实验探究5种不同中药复方对于C2C12细胞增殖能力的影响,发现5种中药复方组C2C12细胞的数量均有所增加,同时处于S期的细胞数目增加,说明中药复方可以促进细胞分裂增殖。其中复方2、复方3、复方4较为明显。3中药复方能增强RAW264.7细胞吞噬功能通过中性红染色法探究5种不同中药复方对于RAW264.7细胞吞噬功能的影响,发现视野下各复方组细胞数量增加,红色区域范围扩大,红色程度加深,说明中药复方可以促进RAW264.7细胞对中性红染液的吞噬,在经过中药复方作用后,复方1、复方3、复方5可以显著提高巨噬细胞活力,增强吞噬能力。4中药复方对小鼠生长发育的影响制备5种中药复方提取液,按照3 g/kg浓度灌胃小鼠,灌胃剂量为10 m L/kg b.w.,饲养周期为14 d。实验期间,每天同一时间给小鼠称重,间隔一天称量饲料及饮水重。通过对小鼠体重进行分析发现,与空白对照组相比,5种中药复方可以促进小鼠体重增长,其中复方1至复方4分别提高7.4%、9.1%、7.8%、8.2%,复方5组提高12.5%（p＞0.05）;通过对饲料重、饮水重进行分析发现,复方5组采食量、饮水量高于其他组（p＞0.05）;通过计算采食量与小鼠体重之比发现,与空白对照组相比,各复方组可以降低料重比,其中复方2、复方4、复方5下降分别降低38.7%、40.0%、41.1%。饲养结束后解剖小鼠,通过提取肌肉组织和肝脏组织RNA,分别检测中药复方对小鼠体内相关基因m RNA表达水平的影响,发现复方1组肌肉中Myod、Myog表达水平显著上升,Myf5表达水平上升（p＞0.05）,Mstn表达水平下降（p＞0.05）;复方2组肌肉中Myod、Myog、Myf5表达水平上升（p＞0.05）,Mstn表达水平下降（p＞0.05）;复方3组上调肌肉中Myod、Myog、Myf5表达水平（p＞0.05）,下调Mstn表达水平（p＞0.05）;复方4组显著上调肌肉中Myf5表达水平和肝脏中GH表达水平,下调肌肉Mstn表达水平（p＞0.05）,上调肝脏IGF-1表达水平（p＞0.05）;复方5组肌肉中Myog、Myf5表达水平显著上升,Mstn表达水平显著下降,Myod表达水平上升（p＞0.05）,肝脏中IGF-1表达水平显著升高,GH表达水平升高（p＞0.05）。提取肌肉组织总蛋白,通过Western Blot方法检测中药复方对小鼠肌肉组织中MSTN表达水平的影响,发现各复方组均下调小鼠肌肉组织中MSTN蛋白表达水平,复方1组、复方2组、复方5组能显著抑制MSTN的表达。5中药复方对小鼠免疫功能的影响饲养结束后解剖小鼠,摘取脾脏及胸腺,用洁净纱布擦干器官表面血液和水分,称取器官重,计算免疫器官指数,发现复方5组可以显著增加脾脏重量,脾脏指数提高49.5%,复方1组、复方2组、复方4组可以增加脾脏重量,脾脏指数分别提高38.1%、29.1%、39.6%,但无显著性差异;复方4组显著增加胸腺重量,胸腺指数提高63.4%,复方1、复方2、复方5小鼠胸腺重量也有所增加,胸腺器官指数分别提高61.3%、25.7%、46.3%。提取脾脏组织RNA,分别检测各中药复方对小鼠脾脏中IL-2、IL-1β表达水平的影响,发现复方4组显著上调脾脏IL-1β表达水平,复方4、复方5显著上调IL-2表达水平,其余复方组IL-1β、IL-2表达水平也有所升高（p＞0.05）。6中药复方对小鼠的急性毒性试验上述实验结果表明中药复方5综合效果较好,对其开展小鼠经口急性毒性试验,测定复方提取液的半数致死量(LD50)和最大耐受量（MTD）,评估中药复方对于小鼠的毒副作用,判断药物的安全性。将中药复方5以20 g/kg b.w.剂量连续3次灌胃小鼠,每次灌胃间隔4-6 h。观察发现,小鼠精神状态、饮欲食欲、行为表现等均正常,未出现中毒或死亡现象,最终确定中药复方5在小鼠的最大耐受量为60 g/kg,属实际无毒药物。7中药复方对肉鸡的应用研究上述实验结果表明,由山楂和黄芪组成的山芪复方（中药复方5）效果最佳,且对小鼠安全无毒。购入一款已上市的阳性药物女贞子提取粉作为阳性对照组,另设空白对照组,0.5%山芪粉组,1%山芪粉组,1%山芪提取液组,探究山芪复方在靶动物上的效果,以及不同给药形式作用效果的差异。研究结果表明,各药物组肉鸡料重比降低,0.5%山芪粉和1%山芪提取液能够显著增加肉鸡体重,分别提高22.6%、19.8%,两组采食量和饮水量也有所增加,提示复方可能是通过促进肉鸡采食和饮水来促进动物增重。女贞子提取粉组能够显著提高Myog的m RNA表达量,0.5%山芪粉能够显著提高Myf5、IGF-1的m RNA表达量,1%山芪粉能够显著提高GH的m RNA表达量,1%山芪提取液能够显著提高IGF-1、GH的m RNA表达量。各药物组能促进肉鸡脾脏、胸腺、法氏囊重量,提高免疫器官指数,0.5%山芪粉能显著增加肉鸡脾脏重量,脾脏指数提高29.3%。1%山芪提取液能够显著提高IL-2的m RNA表达水平,女贞子提取粉和1%山芪粉能够显著提高IFN-γ的m RNA表达量。这些结果表明各药物组能够通过提高生肌调节因子、生长相关因子的表达,抑制肌肉生长抑制素的表达来促进肉鸡生长发育,提高营养物质的储存和利用效率,改善肉鸡生长性能,通过促进免疫器官发育成熟,提高免疫细胞因子水平,改善肉鸡免疫性能。