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结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)是白花菜目、十字花科、芸薹属植物,属于甘蓝(Brassica oleracea L.)的一个变种,其种植栽培地区已遍及全国各地,是我国主要的种植蔬菜之一。甘蓝属于雌雄同花植物,为了避免近交衰退等自花传粉带来的不利影响,甘蓝进化出可以造成杂交优势明显的自交不亲和现象,研究表明包括甘蓝在内的芸薹属植物的自交不亲和性是由具有复等位基因的单一位点——S位点控制。其中自交不亲和反应的起始扳机反应是S位点富含半胱氨酸蛋白(S-locus cysteine-rich protein, SCR)与S位点受体激酶(S-receptor kinase, SRK)之间的相互作用,两者之间相互识别和结合核心区段的位置及氨基酸残基组成尚不完全清楚,是目前的研究热点之一。本研究以结球甘蓝D3的花药cDNA为初始模板,利用巢式RT-PCR、酵母双杂交技术深入研究了S位点受体激酶与S位点富含半胱氨酸蛋白相互作用,主要研究内容和结果如下：1、SCR基因的克隆及其生物信息学分析通过SCR信号肽保守氨基酸和mRNA的ploy A区设计引物,利用巢式PCR,以甘蓝cDNA为模板,克隆了甘蓝D3的SCR基因的部分cDNA序列,长度为319bp,包含一个开放阅读框、3’-UTR区和ploy A区,编码58个氨基酸的SCR蛋白。在二级结构预测上,预测结果显示序列中包含a-螺旋和B-折叠结构。由系统进化树可知,S3与S20的SCR亲缘关系较近,说明这两个单倍型的SCR在演化过程中分支时间较晚；与S28的SCR亲缘关系较远,说明二者的SCR在进化上较早时间开始分支。2、不同截短长度的S位点富含半胱氨酸蛋白(SCR)片段的克隆及其序列特征本研究利用高度自交不亲和材料D3,提取其花药中RNA,获得DNA模板,然后设计引物,通过PCR技术获得相应的目的片段。理论分析表明各个片段其大小是292bp、256bp、39bp、66bp、90bp、135bp、141bp、144bp、60bp、108bp、78bp、54bp、63bp和33bp,可以编码49、39、31、22、30、45、47、38、20、36、26、18、21和11个氨基酸残基。3、母双杂交重组诱饵质粒的毒性及自激活检测Y2Gold[pGBKT7SCRn]和Y2Gold[PGBKT7]转化株在SD/-Trp平板上生长状态良好,并且菌斑大小无明显差异；此表明诱饵质粒pGBKT7SCRn表达对酵母细胞无毒性作用。另外,Y2Gold[pGBKT7SCRn]在SD/-Trp/x-a-Gal平板上生长、在SD/-Trp/x-a-Gal/AbA平板上不生长,其中在SD/-Trp/x-a-Gal平板上生长的菌落无明显蓝色出现,说明pGBKT7SCRn在酵母细胞中没有激活报告基因,无自激活现象出现。4、酵母双杂交法检测甘蓝SCR与SRK之间的相互作用由酵母双杂交试验结果表明同时进行试验的14个实验组中,只有pGADT7eSRKD3xpGBKT7SCR4和pGADT7eSRKD3xpGBKT7SCR5在SD/-Trp/-Leu/x-a-Gal/AbA平板上长出明显的蓝色菌落,说明激活了报告基因,证明酵母双杂交系统可以用于SCR与SRK发生相互作用的识别位点位的证明,试验结果还表明两者相互作用识别位点位于SCR的成熟肽序列开始到Cys3之间,这从实验上首次证明了SCR与SRK的相互识别位点确实在该区域,即SCR3与其相对应的SRK胞外域有相互作用的DNA片段位于SCR的第97～186bp处。由实验组pGADT7eSRK D3xpGBKT7SCR4和PGADT7eSRKD3x pGBKT7SCR5在平板上长出明显的蓝色菌落,但信号肽剪切位点及其邻近的几个氨基酸残基缺失的实验组PGADT7eSRKD3xpGBKT7SCR1和PGADT7eSRKD3xpGBKT7SCR13在平板上无菌落长出的结果说明信号肽剪切位点及其邻近的几个氨基酸残基缺失的实验组SCR1和SCR13与eSRK无相互作用。推测这可能与信号肽剪切位点及其邻近的几个氨基酸残基与其编码的多肽会影响实验结果。