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肌酸水解酶(EC 3.5.3.3)是肌氨酸氧化酶法测定肌酐含量方法中的关键酶,与肌酐水解酶和肌氨酸氧化酶催化肌酐的降解。肌酸水解酶的降解性能的好坏直接影响到酶法测定在临床应用中的推广。虽然人们已经发现了许多可以产生肌酸水解酶的细菌,但对该酶的性质研究较少。
Bacillus sp.BSD-8菌株是由本实验室从土壤中筛选出的细菌,能够以肌酐作为唯一氮源生长,但在细菌发酵过程中却检测不到肌酸水解酶。本论文由肌酸水解酶的克隆入手,通过分子生物学方法进行基因克隆,构建肌酸水解酶重组表达菌株,通过诱导表达和纯化,获得重组酶,进而研究该菌株肌酸水解酶性质。本论文的主要研究成果如下：
(1)从Bacillus sp.BSD-8菌株中克隆肌酸水解酶基因并测序,得到1236bp的片段(accession no.EU546226),编码411氨基酸残基序列。序列分析发现肌酸水解酶基因的调控序列-10区、-35区、SD序列和终止子后的反向互补序列。
(2)成功进行基因克隆,与质粒pET-28a(+)连接,构建肌酸水解酶重组质粒pET-28a-CRE,分别转入大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS,并在IPTG诱导下高效表达。
(3)对重组酶进行Ni-IDA His-Band亲和柱纯化,获得了高浓度高纯度的酶液。纯化后的肌酸水解酶比活为9.94U/mg,在SDS-PAGE中显示为单一条带。
(4)研究重组酶的各项性质,结果发现：酶的最适pH值为7.5,在pH5到8的范围处理24h后残余酶活力均在80％以上；酶的最适反应温度为37℃,在pH 7.5的磷酸盐缓冲液中不同温度处理30min后,测定残余酶活力,结果发现重组酶在45℃以下稳定；酶的动力学常数Km是20.49 mM,kcat约为12.2/s;0.5％的SDS,1mM Cu2+,Hg2+和Ag+对酶活具有完全抑制作用,所有研究的金属离子对酶均无激活作用。
研究发现,该酶的热稳定性和pH稳定性较好,是已报道的肌酸水解酶的热稳定性最高的酶之一。