莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种单细胞真核绿藻,其基因组测序已全部完成,并成功实现了细胞核、叶绿体、线粒体基因组的遗传转化,是很好的模式物种,对我们深入了解微藻油脂代谢的调控机理有着重要意义。糖和脂是衣藻存储能量的两种主要形式,在环境条件不适宜生长时,衣藻细胞内会积累淀粉等糖类和中性脂,且共用相同的碳前体合成淀粉和油脂,因而人们推测衣藻细胞内糖和脂的积累是一个竞争的关系。本研究拟干扰莱茵衣藻的淀粉合成,看能否使本该流入淀粉合成途径的碳前体进入油脂合成途径,从而提高细胞内油脂含量。同时探索RNA干扰的剂量效应。本研究采用人工微RNA(artificial microRNA,amiRNA)技术,以莱茵衣藻淀粉代谢途径中STA6、SSS2和AMYB1基因为干扰对象,目的在于了解这三个基因的沉默对莱茵衣藻油脂积累的影响,同时探索RNA干扰的剂量效应和协同效应。我们首先用套叠PCR的方法构建了含gfp的初始衣藻表达载体pKS-aphⅧ-LIC,在三个单干扰载体的基础上,利用载体上设计的同尾酶,依次构建针对相同基因的双干扰载体双pKS-AMYB1,pKS-2SSS2,pKS-2STA6;针对相同基因的六拷贝干扰载体pKS-6AMYB1,pKS-6SSS2,pKS-6STA6;针对两个不同基因的双干扰载体pKS-AMYB1-SSS2,pKS-AMYB1-STA6,pKS-SSS2-STA6;针对三个不同基因的干扰载体pKS-SSS2-STA6-AMYB1。然后通过电转化法分别将amiRNA表达载体pKS-SSS2,pKS-STA6,pKS-SSS2-STA6,转化莱茵衣藻CC-125细胞,利用碘单质熏蒸的方法从表型筛选低淀粉藻株,然后对转基因衣藻进行淀粉和油脂的定量测定,对低淀粉藻株进行荧光定量PCR,检测基因的表达水平。利用浓硫酸蒽酮法检测转基因藻中淀粉含量,利用浓硫酸蒽酮法检测转基因藻中淀粉含量,结果显示SSS2基因的沉默导致淀粉含量下降59%,STA6基因的沉默导致淀粉含量下降34%,SSS2基因和STA6基因同时沉默导致淀粉下降25%。利用薄层层析法测定衣藻中性脂含量,结果显示SSS2基因的沉默导致TAG含量升高167%%,STA6基因的沉默导致TAG含量升高38%,SSS2基因和STA6基因同时沉默导致TAG含量升高7%。荧光定量PCR结果显示SSS2基因的沉默导致SSS2基因表达量下降94%,STA6基因的沉默导致STA6基因表达量下降58%,SSS2基因和STA6基因同时沉默分别导致SSS2基因表达量下降88%,STA6基因表达量下降56%。