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第一部分构建基于13-MRNA模型预测膀胱癌疾病进展和预后目的:目前尚缺乏可靠的标准来评价非肌肉浸润性膀胱癌的进展风险。本研究的目的是寻找基于基因表达谱的潜在生物学标志物,以更好地预测膀胱癌患者疾病进展和预后。方法:利用GEO芯片中的转录组表达谱数据,鉴定原发性非肌层浸润性膀胱癌和进展性膀胱癌间的差异基因,随后通过单因素COX回归分析和LASSO回归分析构建基于mRNA的预测模型。采用ROC曲线评价模型诊断效能。采用Kaplan-Meier曲线、单因素和多因素COX回归分析基因模型与膀胱癌预后的相关性。采用基因模型联合其他临床病理参数构建列线图。通过GSEA基因集富集分析与基因模型相关的分子生物学功能和信号通路。构建蛋白质蛋白质相互作用网络,寻找模型中的关键基因。结果:通过差异分析和单因素分析,筛选出47个预后相关的mRNA,使用LASSO回归方法构建出基于13-mRNA的与进展相关的预测模型。根据13基因的特征,将患者分为具有不同预后结果的高风险和低风险组。另一独立的GEO芯片和TCGA队列验证后发现13-mRNA评分模型具有良好的诊断和预后预测价值,多因素COX分析发现13基因模型是总生存期的独立预后因素。ROC分析表明,相较于其他已报道的预测标记物,该模型在验证集中表现更好。基于13基因模型建立的列线图可以很好地预测NMIBC的进展。GSEA分析发现“趋化因子信号传导途径”,“FOXM1途径”,“上皮间质转化”,“炎症反应”等通路富集在高风险组。蛋白质相互作用网络中CTHRC1,MMP11,AEBP1,SNCAIP,COL1A1和S100A8被确定为中心基因。结论:基于13-mRNA的预测模型有助于更好地预测膀胱癌疾病进展和预后,并可能作为膀胱癌治疗的潜在靶点或成为膀胱癌早期筛查的重要生物学标记物。第二部分CTHRC1促进膀胱癌侵袭转移及其分子机制目的:探究CTHRC1在不同类型膀胱癌中表达水平,通过体内外功能实验研究CTHRC1在膀胱癌细胞中发挥的生物学功能及其相关的信号通路。方法:利用公共数据库,联合免疫组化、RT-q PCR、Western blot等方法分析人膀胱癌和癌旁组织,以及人膀胱癌细胞系和正常尿路上皮细胞中CTHRC1表达水平。通过卡方检验分析CTHRC1与临床病理特征的相关性。通过Kaplan-Meier曲线和单因素、多因素COX回归分析CTHRC1对总生存期的影响。通过RNAi和慢病毒载体对膀胱癌细胞CTHRC1水平进行干扰或稳定过表达,利用细胞划痕实验和Transwell法检测CTHRC1对膀胱癌细胞迁移侵袭的影响。构建尾静脉转移瘤模型评价CTHRC1对膀胱癌细胞体内肺转移的影响。GSEA分析预测CTHRC1相关的潜在分子机制。Western blot检测相关信号通路的改变及其功能。结果:TCGA测序数据和Array Express芯片数据分析、免疫组化、RT-q PCR和Western blot结果发现,相较于正常尿路上皮和非肌层浸润性膀胱癌组织和细胞,CTHRC1在肌层浸润性膀胱癌组织和细胞中表达显著上调。CTHRC1过表达与患者TNM分期(P<0.001)、p T分期(P=0.010)和p N分期(P=0.002)密切相关。高CTHRC1表达组中患者总生存期OS明显比低表达组更短(HR=3.23,95%CI:1.82~5.73,P<0.001)。多因素COX回归分析发现,CTHRC1是预测膀胱癌患者OS(HR=2.91,95%CI:1.54~5.50,P=0.001)的独立预后因素。随后的细胞功能实验显示,干扰CTHRC1表达后膀胱癌细胞迁移侵袭能力减弱,而过表达CTHRC1则可增强体外膀胱癌细胞恶性生物学行为,并促进膀胱癌细胞体内肺转移能力。GSEA分析显示,细胞黏着斑激酶和FAK通路富集到高CTHRC1表达组。Western blot证实重组CTHRC1可促进膀胱癌细胞FAK和ERK1/2通路发生磷酸化,运用特异性抑制剂阻断FAK和ERK1/2后CTHRC1诱导的细胞迁移侵袭力减弱,伴随MMP9转录水平降低。结论:相较于正常尿路上皮和低浸润性膀胱癌,CTHRC1在浸润性膀胱癌中表达上调。CTHRC1表达与膀胱癌的预后密切相关,且可作为膀胱癌的独立预后因素。调控CTHRC1可影响膀胱癌细胞侵袭转移能力。在机制方面,CTHRC1可激活黏着斑激酶的关键蛋白phospho-FAK及其下游的phospho-ERK1/2,CTHRC1诱导的膀胱癌细胞侵袭转移是由FAK和ERK1/2信号通路介导。第三部分CTHRC1表达上调的上游调控机制目的:深入研究调控CTHRC1转录活性的上游分子机制,阐明CTHRC1在膀胱癌中表达上调的原因。方法:数据库分析CTHRC1与TGFB1相关性。RT-q PCR和Western blot检测TGF-β1对CTHRC1表达的影响。JASPAR和PROMO预测与CTHRC1启动子区域结合的转录因子。pc DNA3.1-Sp1质粒转染膀胱癌UMUC-3细胞后检测CTHRC1表达变化。双荧光素酶报告基因实验、Ch IP、RT-q PCR和Western blot实验探究Sp1与CTHRC1启动子的结合以及TGF-β1对二者结合的作用。结果:对TCGA来源的测序数据进行相关性分析,发现CTHRC1与TGFB1表达呈正相关,Spearman相关系数为0.41。不同浓度的TGF-β1处理UMUC-3细胞后CTHRC1 m RNA和蛋白表达水平增加。JASPAR和PROMO预测发现CTHRC1启动子区域存在Sp1结合元件。转染Sp1后UMUC-3细胞CTHRC1 m RNA和蛋白表达水平较Vector对照组升高。Ch IP证实Sp1与CTHRC1启动子区域存在结合。双荧光素酶报告基因实验发现转染Sp1可增加荧光素酶活性,缺失突变后Sp1诱导的荧光素酶活性减弱。使用特异性抑制剂降低Sp1表达后TGF-β1诱导的CTRHC1表达水平下降。相较于对照组,TGF-β1刺激增强荧光素酶活性以及Sp1与DNA的结合能力。结论:TGF-β1诱导膀胱癌细胞CTHRC1表达。Sp1可与CTHRC1启动子区域结合,导致转录激活。TGF-β1通过Sp1依赖途径增强CTHRC1转录活性。