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目的 干细胞是指具有自我更新能力及多向分化潜能的细胞。虽然胚胎干细胞、神经干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、皮肤干细胞、胃肠干细胞等相继发现，并且造血干细胞已部分应用于临床。但呼吸道中的干细胞尚为推测中的功能细胞，其定位尚未解决。进行支气管干细胞的定位研究，对阐明支气管损伤修复的机理、肺癌的组织发生等有重要的理论意义，而且有自体支气管重建的实用价值，将来甚至可能形成生物医学产业。 本研究应用光镜、电镜、AB-PAS染色、免疫组织化学等方法，于原位观察人支气管上皮经5-FU损伤后的修复过程，从中发现支气管干细胞。因干细胞具有不被Rhodamine123染色的特性，并且此特性与细胞表面ATP依赖性外排泵——P-糖蛋白有关，因此本研究还应用流式细胞仪、免疫荧光法、蛋白印迹法、RT-PCR等方法检测损伤修复过程中Rhodamine123的动态变化及P-糖蛋白的表达情况，进一步进行支气管干细胞的性状解析。 方法 1．支气管损伤模型的建立取肺癌手术切除的人支气管的正常部分进行组织培养。平行于支气管环方向将离体人支气管切成2-3mm宽的组织块，置于含Ham’s F12培养液的培养皿中。实验组：将支气管环置于含5-FU浓度为12.5mg／ml的Ham’s F12培养液中，于5％CO2，37℃二氧化碳孵箱中孵育，12小时后弃去上述培养液，换成新鲜的Ham’s F12培养液继续培养；于换液培养后0、3、6、12、24、48、72小时分别取出一段组织块；对照组：应用等体积生理盐水代替5-FU，其余培养条件及取材时间同实验组。 2．支气管上皮的损伤修复过程分别应用光镜、电镜、AB-PAS染色动态观察5-FU损伤后的修复过程，用免疫组织化学SP法检测此过程中PCNA，β1-整合素及CK-19的表达。 3．Hoechst33342荧光染色 干细胞具有不被Hoechst33342染色的特性。分别取实验组及对照组支气管环，在解剖显微镜下机械剥离支气管上皮粘膜，涂布于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，吹干。将Hoechst33342滴加在支气管粘膜细胞涂片上，避光37℃孵育30分钟，PBS洗3次，荧光显微镜观察。 4.流式细胞仪分析分别取正常组及5一FU作用后的支气管上皮，用蛋白酶消化法获取支气管上皮细胞悬液，应用流式细胞仪分析: l)PI染色，应用PI染液一步法，4℃避光孵育30而n，400目滤网过滤，上流式细胞仪FACSean（Beeton Dieldnson）检测。经CellQuest软件分析，确定细胞周期各期细胞百分数; 2)活细胞的助odal址ne123的染色，支气管上皮细胞悬液内加Rhoda-而ne 123，终浓度为10例扩nil，于37℃孵育30而n，PBS洗2次，再加不含R加-damine123的DMEM培养液37℃避光孵育1小时，PBS洗2次，为排除坏死细胞的干扰，加PI工作液，终浓度为2林岁而，染色5而n后立刻经流式细胞仪检测。动态观察损伤修复过程中Rhodaminel23阴性细胞所占比例。 5.P一糖蛋白的表达情况取5一FU作用前后的支气管上皮，分别应用免疫荧光、流式细胞仪及蛋白印迹法分析P一糖蛋白的表达情况。 6.应用RT一PCR法检测P一糖蛋白mRNA的表达，使用Trizol提取5一FU处理前后人支气管上皮总RNA，引物序列如下:MDRI一FS’一CCCATC Al，r GCA ATA GCA GG一3’MDRI一RS’一CTT CAA ACT TCT GCTCCT GA一3’扩增产物为167坤，Takala一步法RT一PCR试剂盒检测，扩增产物进行2%琼脂糖电泳，相同条件下，用p一actin作为内对照，扩增产物为69obp，以Kodak1D型凝胶自动成像分析系统拍照。结果 1 .5一FU作用12小时后，人支气管上皮细胞绝大部分脱落，仅见少量间隔分布的类似裸核的细胞呈钉状位于基底膜上，PCNA染色阴性，证明为G0期细胞。其中部分细胞Hoechat33342染色阴性。 2.将5一FU去除3一6小时后，细胞形态变为扁平，PCNA染色见核染色阳性的细胞与阴性细胞（G。期细胞）间隔分布;24小时后细胞变为立方，细胞数目逐渐增多;到48一72小时恢复假复层柱状上皮。 3.p;一整合素及CK一19在已分化细胞中呈阳性反应。 4.透射电镜结果:5一FU作用12小时后人支气管上皮细胞核大，核浆比例增大，细胞器少，未见粘液颗粒。 5.细胞周期分析结果:正常支气管上皮细胞中G0/G;期细胞占活细胞的86.54士4.50%;5一FU处理后坏死及凋亡细胞占13.62土4.90%，S+GZ/M期细胞明显减少，G0/G;期细胞占活细胞比例增多，占93.33土4 .95%。 6.正常对照组Rhada而ne123阴性细胞占活细胞的10.46士2.17%，5-FU作用后支气管上皮Rhodaminel23阴性细胞占活细胞比例增加，为17 .82土3.16%，差异有显著意义。 7.应用免疫荧光法可见:5一FU作用后的支气管上皮细胞涂片上有P一糖蛋白的表达;流式细胞仪分析:正常人支气管上皮中P一糖蛋白阳性细胞数占12.34土1.71%，5一F’U作用后的支气管上皮P一糖蛋白阳性细胞增加，占17.54士1.41%;蛋白印迹法提示:5一FU作用后的支气管上皮较正常人支气管上皮P一糖蛋白表达量增加。RT一PCR法提示:5一FU作用后的支气管上皮较正常组P一糖蛋白mRNA的表达也有增加趋势。结论 1.本研究首次应用5一FU作为损伤因