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研究背景脓毒症(Spesis)是严重烧伤、创伤及外科大手术后常见并发症,现已成为危重患者死亡的主要原因之一。临床上由细菌感染引发的脓毒症占到了95%以上,而细菌感染引起的内毒素脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的释放是导致脓毒症的主要因素。当LPS入侵机体时,首先发挥作用的便是单核-巨噬细胞系统,巨噬细胞表面的Toll样受体4识别LPS并激活巨噬细胞胞内信号传导,产生大量的促炎性细胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等,细胞因子通过血液循环或旁分泌到达远端靶器官或靶细胞并发挥生物学效应,引起全身炎症反应,导致脓毒症的发生。鉴于巨噬细胞在LPS诱发的脓毒症的发生发展中发挥着关键性的始动作用,因此,寻找并鉴定新的巨噬细胞炎症反应的调控分子对于全面认识了解脓毒症具有重要的意义。蛋白4.1R是蛋白4.1家族的成员,此家族还包括蛋白4.1B、蛋白4.1N、蛋白4.1G。蛋白4.1家族的成员拥有4个保守的结构域:FERM结构域,FERM相邻的调节结构域、血影蛋白-肌动蛋白结合结构域和C-末端结构域。蛋白4.1R作为膜骨架蛋白,衔接多种跨膜蛋白与细胞骨架蛋白,能够维持细胞正常形态;介导细胞运动和粘附;调节细胞生长、分化。近年来,蛋白4.1R因在免疫细胞中发挥重要的调节作用而受到广泛的关注,CD4~+T细胞中,蛋白4.1R通过结合T细胞活化连接蛋白(Linker for activation of T cells,LAT)并抑制ZAP-70对LAT的磷酸化从而负调控CD4~+T细胞增殖及分化。最近的研究报道表明,同样拥有FERM结构域的膜突蛋白能够参与巨噬细胞中的TLR4/NFκB信号通路,研究结果提示蛋白4.1R可能在LPS诱导巨噬细胞炎症反应中发挥作用,从而可能会参与脓毒症的发生发展。研究目的本课题利用野生型(4.1R+/+)和4.1R基因缺陷型(4.1R-/-)C57BL/6小鼠腹腔接种LPS建立小鼠脓毒症模型,研究蛋白4.1R在脓毒症中的作用;进而利用4.1R+/+小鼠和4.1R-/-小鼠骨髓诱导的巨噬细胞,体外探讨蛋白4.1R在LPS诱导巨噬细胞炎症反应中的调控作用,从而为深入阐明脓毒症的发病机制提供研究基础,并为治疗脓毒症提供新的思路。研究方法1.4.1R+/+和4.1R-/-C57BL/6小鼠腹腔接种LPS建立脓毒症模型,监测小鼠的生存期。2.ELISA检测4.1R+/+和4.1R-/-脓毒症小鼠血清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及趋化因子MCP-1的分泌。3.取4.1R+/+和4.1R-/-脓毒症小鼠肝组织做组织切片、H&E染色以及巨噬细胞免疫组化。4.荧光定量PCR检测4.1R+/+和4.1R-/-脓毒症小鼠肝组织中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及趋化因子MCP-1的表达。5.体外诱导4.1R+/+和4.1R-/-C57BL/6小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM),流式检测4.1R+/+BMDM和4.1R-/-BMDM细胞纯度。6.PCR技术和Western blotting印记鉴定4.1R+/+BMDM和4.1R-/-BMDM细胞中4.1R的表达,并绘制BMDM细胞中4.1R基因的外显子图谱。7.荧光定量PCR和ELISA分别检测LPS刺激4.1R+/+BMDM和4.1R-/-BMDM细胞后促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12以及趋化因子MCP-1的表达与分泌。8.Western blotting印记检测LPS刺激4.1R+/+BMDM和4.1R-/-BMDM细胞后MAPKs信号通路的活化。研究结果1.建立小鼠脓毒症模型后,4.1R-/-小鼠表现为发病更早,死亡率更高。2.4.1R-/-脓毒症小鼠血清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及趋化因子MCP-1的分泌显著高于4.1R+/+脓毒症小鼠。3.4.1R-/-脓毒症小鼠肝组织水肿及损伤更严重,并且4.1R-/-脓毒症小鼠肝组织浸润的巨噬细胞数量更多。4.4.1R-/-脓毒症小鼠肝组织中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及趋化因子MCP-1的表达显著高于4.1R+/+脓毒症小鼠。5.流式检测4.1R+/+BMDM和4.1R-/-BMDM细胞纯度分别为94.7%和94.0%,可用于后续实验。6.PCR技术和Western blotting印记分别从基因水平和蛋白水平证实了4.1R-/-BMDM细胞中4.1R的表达缺失;4.1R基因的外显子图谱分析表明BMDM细胞中4.1R基因缺失了外显子14、15、16。7.LPS刺激后,4.1R-/-BMDM细胞中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12以及趋化因子MCP-1的表达和分泌显著高于4.1R+/+BMDM细胞。8.LPS刺激后,4.1R-/-BMDM细胞MAPK信号通路中p-JNK蛋白和p-ERK蛋白的表达显著高于4.1R+/+BMDM。研究结论蛋白4.1R能够抑制LPS刺激巨噬细胞后促炎性细胞因子的产生,从而在LPS诱导的脓毒症中发挥重要的负调控的作用。