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目的：运用高通量测序技术筛选痰湿型多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)患者、非痰湿型PCOS患者与正常女性卵巢颗粒细胞基因表达谱的差异基因，并对相关差异基因进行功能分析和通路分析，以基因表达谱为基础探讨痰湿型PCOS患者的发病机制。在此基础上，比较痰湿型PCOS患者应用燥湿化痰经典方药苍附导痰丸对证治疗后与安慰剂用药后卵巢颗粒细胞基因表达的差异，在卵巢颗粒细胞基因谱表达层面上探讨燥湿化痰中药苍附导痰颗粒对痰湿型PCOS患者产生的影响及其疗效作用机制。
方法：1、第一部分：选取在临床治疗中接受体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization-Embryo Transferred，IVF-ET)的痰湿型PCOS患者、非痰湿型PCOS患者以及正常女性各60例作为研究对象。痰湿组为确诊为痰湿型的PCOS患者，正常对照组为因男方因素行IVF的正常女性。在IVF控制性超排卵方案中三组均采用目前常规应用的标准长方案，提取在取卵日收集卵泡液颗粒细胞中的RNA。观察三组患者的获卵数、优质卵数、受精卵数、优质卵率、受精率、优质胚胎率以及临床妊娠率；采取纯化后合格的RNA样本构建文库，利用Bowtie2软件分析Hiseq2000高通量测序仪测序得出的结果，使用Ensemble生物学公共数据库分析三组在基因谱上有表达量差异的基因，对表达差异基因利用基因本体(Gene Ontology，GO)数据库进行GO功能注释分析及利用京都基因和基因组(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库进行KEGG通路分析。三组每个mRNA的差异表达情况使用基于负二项分布检验的DESeq6计算，差异表达的基因标准：pvalue＜0.05，同时Foldchange＞2.0或者＜0.5。对差异RNA靶基因通过DAVIDFunctionalAnnotationTool(DAVID Bioinformatics Resources6.7,NIAID/NIH)工具进行GO功能注释及KEGG通路分析，差异基因范围通过差异分析及富集分析进一步缩小从而探究痰湿型PCOS可能的生物标志物，并推测苍附导痰颗粒对其作用靶点及作用机制。
2、第二部分：选取临床上痰湿型多囊卵巢综合征行IVF-ET治疗的患者120例，采用随机数字表法分为治疗组和安慰剂组各60例。治疗组服用苍附导痰颗粒在IVF治疗当周期和前一月经周期，而对照组服用安慰剂颗粒；两组均采用目前常规应用的标准长方案，提取在取卵日收集卵泡液颗粒细胞中的RNA。从提取RNA到构建文库、分析生物信息两组样本同第一部分。观察两组患者从入组到取卵日的痰湿证候积分及胰岛素抵抗的稳态模型评估(Homeostatic Model Assessment for Insulin Resistance， HOMA-IR)变化情况；观察两组患者的促性腺激素(gonadotropins，Gn)用量及天数，获卵数、优质卵数、受精卵数、优质卵率、受精率、优质胚胎率以及临床妊娠率；同第一部分两组的差异表达基因采用Bowtie2软件分析，进行GO功能注释以及KEGG通路分析。
结果：1、三组患者获卵数、优质卵数及受精卵数存在差异，正常对照组明显低于痰湿组及非痰湿组；但痰湿组、非痰湿组和正常对照组患者的优质卵率、受精率、优质胚胎率及临床妊娠率比较，正常对照组明显高于痰湿组及非痰湿组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
2、痰湿组和正常对照组患者的卵巢颗粒细胞间存在表达差异基因，获得表达差异基因共38032条，有统计学意义的共245条(P＜0.05)；其中，痰湿组较正常对照组表达水平上调(FC＞2)的有133条，表达水平下调(FC＜0.5)的有112条。非痰湿组和正常对照组患者的卵巢颗粒细胞间存在表达差异基因，获得表达差异基因共38032条，有统计学意义的共384条(P＜0.05)；其中，非痰湿组较正常对照组表达水平上调(FC＞2)的有242条，表达水平下调(FC＜0.5)的有142条。痰湿组和非痰湿组患者的卵巢颗粒细胞间存在表达差异基因，获得表达差异基因共38032条，有统计学意义的共353条(P＜0.05)；其中，痰湿组较非痰湿组表达水平上调(FC＞2)的有165条，表达水平下调(FC＜0.5)的有188条。这些表达差异的基因按照GO功能注释，主要涉及到参与细胞因子活性、细胞增殖、免疫反应、炎症应答、生物合成、细胞凋亡、信号传导等方面；按照KEGG通路分析涉及到多个信号转导通路，包括细胞因子受体相互作用通路(cytokine-cytokine receptor interaction)、IL-17信号通路、P53信号通路、趋化因子信号通路(chemoking signaling pathway)、TGF信号通路等。
3、苍附导痰颗粒治疗组与安慰剂组相比，在痰湿证候积分变化、HOMA-IR差值变化、优质卵率、受精率、优质胚胎率上均存在差异，治疗组均明显优于安慰剂组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
4、治疗组与安慰剂组患者的卵巢颗粒细胞存在表达差异基因，获得表达差异基因共38032条，有统计学意义的共779条(P＜0.05)；其中，治疗组较安慰剂组表达水平上调(FC＞2)的有176条，表达水平下(FC＜0.5)的有603条。这些表达差异的基因按照GO功能注释，主要涉及到参与细胞因子活性、细胞增殖、免疫反应、炎症应答、生物合成、细胞凋亡、信号传导等方面；按照KEGG通路分析涉及到多个信号转导通路，包括细胞因子受体相互作用通路(cytokine-cytokine receptor interaction)、IL-17信号通路、P53信号通路、趋化因子信号通路(chemoking signaling pathway)、TGF信号通路等。
结论：1、痰湿型PCOS患者、非痰湿型PCOS患者的优质卵率、受精率、优质胚胎率及临床妊娠率均低于正常女性，表明PCOS患者较正常女性生殖功能降低。痰湿型PCOS患者与非痰湿型PCOS患者及正常女性基因表达谱相比，颗粒细胞中CXCL5表达上调、TNFRSF13C表达上调、Leptin表达上调、STAT4表达上调、SOCS2表达上调、TNFRSF11A表达下调、AMHR2表达下调。2、痰湿型PCOS患者的获卵数、优质卵数、受精卵数、优质卵率、受精率、优质胚胎率及临床妊娠率均低于非痰湿型PCOS患者，表明痰湿型PCOS患者较非痰湿型PCOS患者生殖功能降低。痰湿型PCOS患者与非痰湿型PCOS患者在基因组表达谱上存在明显差异，痰湿型PCOS患者卵巢功能降低乃至生殖障碍的原因之一可能是参与细胞因子活性与生物合成、炎症应答与信号传导等方面的基因存在异常表达。3、苍附导痰颗粒对痰湿型PCOS患者的痰湿证候及HOMA-IR有明显改善，并提高患者的优质卵率、受精率、优质胚胎率、临床妊娠率等，为苍附导痰颗粒对生殖功能的提高提供了临床依据。4、痰湿型PCOS患者经苍附导痰颗粒干预后卵巢颗粒细胞基因组表达谱中CXCL5表达下调、TNFRSF13C表达下调、Leptin表达下调、STAT4表达下调、SOCS2表达下调、TNFRSF11A表达上调、AMHR2表达上调，表明燥湿化痰中药苍附导痰颗粒改善痰湿型PCOS患者生殖功能及妊娠结局的原因之一可能是通过调节有关细胞因子活性与生物合成、炎症应答与信号传导等方面基因的表达，在基因组学层面上为苍附导痰颗粒改善生殖功能提供了理论依据。5、上述结论可以为中医学“痰湿致不孕”以及“燥湿化痰促生殖”经典理论提供基因水平上的科学依据。
方法：1、第一部分：选取在临床治疗中接受体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization-Embryo Transferred，IVF-ET)的痰湿型PCOS患者、非痰湿型PCOS患者以及正常女性各60例作为研究对象。痰湿组为确诊为痰湿型的PCOS患者，正常对照组为因男方因素行IVF的正常女性。在IVF控制性超排卵方案中三组均采用目前常规应用的标准长方案，提取在取卵日收集卵泡液颗粒细胞中的RNA。观察三组患者的获卵数、优质卵数、受精卵数、优质卵率、受精率、优质胚胎率以及临床妊娠率；采取纯化后合格的RNA样本构建文库，利用Bowtie2软件分析Hiseq2000高通量测序仪测序得出的结果，使用Ensemble生物学公共数据库分析三组在基因谱上有表达量差异的基因，对表达差异基因利用基因本体(Gene Ontology，GO)数据库进行GO功能注释分析及利用京都基因和基因组(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库进行KEGG通路分析。三组每个mRNA的差异表达情况使用基于负二项分布检验的DESeq6计算，差异表达的基因标准：pvalue＜0.05，同时Foldchange＞2.0或者＜0.5。对差异RNA靶基因通过DAVIDFunctionalAnnotationTool(DAVID Bioinformatics Resources6.7,NIAID/NIH)工具进行GO功能注释及KEGG通路分析，差异基因范围通过差异分析及富集分析进一步缩小从而探究痰湿型PCOS可能的生物标志物，并推测苍附导痰颗粒对其作用靶点及作用机制。
2、第二部分：选取临床上痰湿型多囊卵巢综合征行IVF-ET治疗的患者120例，采用随机数字表法分为治疗组和安慰剂组各60例。治疗组服用苍附导痰颗粒在IVF治疗当周期和前一月经周期，而对照组服用安慰剂颗粒；两组均采用目前常规应用的标准长方案，提取在取卵日收集卵泡液颗粒细胞中的RNA。从提取RNA到构建文库、分析生物信息两组样本同第一部分。观察两组患者从入组到取卵日的痰湿证候积分及胰岛素抵抗的稳态模型评估(Homeostatic Model Assessment for Insulin Resistance， HOMA-IR)变化情况；观察两组患者的促性腺激素(gonadotropins，Gn)用量及天数，获卵数、优质卵数、受精卵数、优质卵率、受精率、优质胚胎率以及临床妊娠率；同第一部分两组的差异表达基因采用Bowtie2软件分析，进行GO功能注释以及KEGG通路分析。
结果：1、三组患者获卵数、优质卵数及受精卵数存在差异，正常对照组明显低于痰湿组及非痰湿组；但痰湿组、非痰湿组和正常对照组患者的优质卵率、受精率、优质胚胎率及临床妊娠率比较，正常对照组明显高于痰湿组及非痰湿组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
2、痰湿组和正常对照组患者的卵巢颗粒细胞间存在表达差异基因，获得表达差异基因共38032条，有统计学意义的共245条(P＜0.05)；其中，痰湿组较正常对照组表达水平上调(FC＞2)的有133条，表达水平下调(FC＜0.5)的有112条。非痰湿组和正常对照组患者的卵巢颗粒细胞间存在表达差异基因，获得表达差异基因共38032条，有统计学意义的共384条(P＜0.05)；其中，非痰湿组较正常对照组表达水平上调(FC＞2)的有242条，表达水平下调(FC＜0.5)的有142条。痰湿组和非痰湿组患者的卵巢颗粒细胞间存在表达差异基因，获得表达差异基因共38032条，有统计学意义的共353条(P＜0.05)；其中，痰湿组较非痰湿组表达水平上调(FC＞2)的有165条，表达水平下调(FC＜0.5)的有188条。这些表达差异的基因按照GO功能注释，主要涉及到参与细胞因子活性、细胞增殖、免疫反应、炎症应答、生物合成、细胞凋亡、信号传导等方面；按照KEGG通路分析涉及到多个信号转导通路，包括细胞因子受体相互作用通路(cytokine-cytokine receptor interaction)、IL-17信号通路、P53信号通路、趋化因子信号通路(chemoking signaling pathway)、TGF信号通路等。
3、苍附导痰颗粒治疗组与安慰剂组相比，在痰湿证候积分变化、HOMA-IR差值变化、优质卵率、受精率、优质胚胎率上均存在差异，治疗组均明显优于安慰剂组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
4、治疗组与安慰剂组患者的卵巢颗粒细胞存在表达差异基因，获得表达差异基因共38032条，有统计学意义的共779条(P＜0.05)；其中，治疗组较安慰剂组表达水平上调(FC＞2)的有176条，表达水平下(FC＜0.5)的有603条。这些表达差异的基因按照GO功能注释，主要涉及到参与细胞因子活性、细胞增殖、免疫反应、炎症应答、生物合成、细胞凋亡、信号传导等方面；按照KEGG通路分析涉及到多个信号转导通路，包括细胞因子受体相互作用通路(cytokine-cytokine receptor interaction)、IL-17信号通路、P53信号通路、趋化因子信号通路(chemoking signaling pathway)、TGF信号通路等。
结论：1、痰湿型PCOS患者、非痰湿型PCOS患者的优质卵率、受精率、优质胚胎率及临床妊娠率均低于正常女性，表明PCOS患者较正常女性生殖功能降低。痰湿型PCOS患者与非痰湿型PCOS患者及正常女性基因表达谱相比，颗粒细胞中CXCL5表达上调、TNFRSF13C表达上调、Leptin表达上调、STAT4表达上调、SOCS2表达上调、TNFRSF11A表达下调、AMHR2表达下调。2、痰湿型PCOS患者的获卵数、优质卵数、受精卵数、优质卵率、受精率、优质胚胎率及临床妊娠率均低于非痰湿型PCOS患者，表明痰湿型PCOS患者较非痰湿型PCOS患者生殖功能降低。痰湿型PCOS患者与非痰湿型PCOS患者在基因组表达谱上存在明显差异，痰湿型PCOS患者卵巢功能降低乃至生殖障碍的原因之一可能是参与细胞因子活性与生物合成、炎症应答与信号传导等方面的基因存在异常表达。3、苍附导痰颗粒对痰湿型PCOS患者的痰湿证候及HOMA-IR有明显改善，并提高患者的优质卵率、受精率、优质胚胎率、临床妊娠率等，为苍附导痰颗粒对生殖功能的提高提供了临床依据。4、痰湿型PCOS患者经苍附导痰颗粒干预后卵巢颗粒细胞基因组表达谱中CXCL5表达下调、TNFRSF13C表达下调、Leptin表达下调、STAT4表达下调、SOCS2表达下调、TNFRSF11A表达上调、AMHR2表达上调，表明燥湿化痰中药苍附导痰颗粒改善痰湿型PCOS患者生殖功能及妊娠结局的原因之一可能是通过调节有关细胞因子活性与生物合成、炎症应答与信号传导等方面基因的表达，在基因组学层面上为苍附导痰颗粒改善生殖功能提供了理论依据。5、上述结论可以为中医学“痰湿致不孕”以及“燥湿化痰促生殖”经典理论提供基因水平上的科学依据。