獭兔是著名的皮用兔,兼顾产肉。獭兔的养殖已经成为我国养殖业的一个新热点,其被毛具有"短、平、密、细、美、牢"的特点,在獭兔养殖中,獭兔的毛皮品质有着重要的经济价值。评定獭兔毛皮品质的主要指标有被毛密度、被毛长度、粗毛率、绒毛细度和皮张面积等,其中被毛密度和皮张面积最重要。近年来,如何提高獭兔毛皮品质已经成为獭兔生产中最重要的关注点。山羊、水貂等动物皮肤和毛囊的研究结果表明,毛囊结构与其产毛量和毛皮质量有密切关系。作为一个比较新型的养殖物种,獭兔被毛密度与毛囊发育研究在国内外报道较少。本研究即以獭兔毛囊发育规律为基础,采用动物饲养试验、离体组织器官培养和分子生物学相结合,从活体和组织器官两个方面研究Wnt1Ob在生长獭兔毛囊周期中的变化,对毛囊发育的影响以及营养素蛋氨酸调控獭兔毛囊发育的作用机制,以期为营养调控獭兔被毛品质提供技术支撑,为提高獭兔毛皮品质提供科学依据。1.出生～8周龄獭兔毛囊发育规律的研究本研究以出生～8周龄獭兔背部皮肤为研究对象,通过组织学观察皮肤毛囊发育情况。横切皮肤发现出生0周龄时背部毛囊主要为初级毛囊,初级毛囊周围分布次级毛囊数量较少;2周龄时次级毛囊数量开始增多,初级毛囊周围次级毛囊数量基本达到2～3个;4周龄时次级毛囊未见明显增多,但初级毛囊直径变大明显;6周龄和8周龄时初级毛囊周围次级毛囊分化明显增多。纵切皮肤发现0周龄时毛囊主要处于生长期;2周龄时有生长期和退化期毛囊共存;4周龄时有生长期、退化期和静止期三种毛囊形态共存,同时发现了毛囊变大的变化;6周龄和8周龄时大多数毛囊又处于生长期。对皮肤表皮层和真皮层厚度统计发现,0～8周龄背部皮肤表皮层和真皮层厚度变化明显(P<0.05),表皮层厚度呈先降低后升高的变化,在4周龄和6周龄时厚度最小;真皮层厚度变化呈先升高后降低再升高的变化,0周龄和4周龄时厚度达到最小,8周龄时厚度最大。表明獭兔毛囊发育存在周期性。2.出生～8周龄獭兔毛囊发育相关基因表达规律的研究对出生～8周龄獭兔毛囊发育相关基因IGF-Ⅰ、IGF-IR、EGF、BMP2、FGF-5、Kap3.1、Kap6.1、GHR、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3表达规律研究发现,出生0周龄时各基因均存在一定的表达,说明獭兔的毛囊发育在胚胎时期已经开始进行。IGF-Ⅰ、EGF、TGFβ-2、TGFβ-3的mRNA表达水平均在2周龄时显著低于出生时(0周龄)(P<0.05),之后表达水平呈逐渐增高;IGF-IRmRNA表达水平呈先降低后升高的变化,在2周龄和6周龄时显著低于出生0周龄和8周龄(P<0.05);TGFβ-1基因表达水平在2、4周龄时表达显著高于6、8周龄并在2周龄时表达达到最高(P<0.05);Kap3.1的基因mRNA表达水平在2周龄时显著高于出生后,然后进入缓慢上升的平台期,并在8周龄时显著升高(P<0.05)。Kap6.1 mRNA表达水平在4周龄时达到最低,之后表达水平逐渐升高并在 8 周龄时达到最大值(P<0.05);GHR(P<0.05)、FGF-5(P<0.05)和 BMP2(P<0.05)mRNA表达水平呈先出先升高后降低再升高。3.Wnt10b在獭兔毛囊周期中的表达观察试验对出生～8周龄獭兔背皮中Wnt10b及经典Wnt通路中β-catenin和跨膜受体蛋白Dsh表达规律进行分析发现,出生～8周龄背部皮肤中Wnt10b mRNA表达无显著差异(P>0.05),β-catenin基因表达变化差异明显(P<0.05)。但对 Wnt10b、β-catenin和Dsh在背部皮肤中的蛋白表达分析发现,Wnt10b(P<0.05)、β-catenin(P<0.05)和Dsh(P<0.05)的蛋白表达在2周龄和4周龄时表达量达到最低。Wnt10b和β-catenin的mRNA和蛋白表达不一致,推测与该时期翻译后蛋白质的合成加工有关。免疫组化定位Wnt10b在毛囊的表达,发现Wnt10b特异性的表达于獭兔生长期的毛母质细胞,同时在内外根鞘也有表达。在退化期主要表达于内外根鞘,在静止期獭兔毛囊中少见Wnt10b的表达。结果表明Wnt10b可能参与了獭兔毛囊的发育调控,并推测其调控作用途径为经典Wnt通路。4.Wnt10b在獭兔毛囊周期中的作用及作用的信号通路研究进一步研究Wnt10b在獭兔毛囊发育中的作用,我们采用建立獭兔游离触须毛囊培养模型和在体注射模型,从组织器官和活体两方面研究Wnt10b在獭兔毛囊周期变化中的作用。结果表明,Wnt10b腺病毒处理组的触须毛囊毛干生长速度显著快于对照组(P<0.05)。在体注射模型皮内注射Wnt10b腺病毒后,处理组的注射部位毛发生长明显快于未注射部位。表明Wnt10b对毛囊的生长有诱导促进作用。XAV-939能特异性的抑制经典Wnt信号通路,在游离触须毛囊基础培养基中加入XAV-939处理,发现处理组毛囊毛干生长速度显著慢于对照组,毛干生长速度受到明显抑制(P<0.05)。在体注射模型皮内注射XAV-939后,处理组的注射部位毛发生长变慢。因此推测Wnt10b对毛囊的促进作用是通过Wnt经典通路来实现的。5.Met对獭兔毛囊发育相关基因表达的影响选取30日龄断奶獭兔200只,体重相近,随机分为4组,饲喂0、0.30%、0.60%、0.90%Met添加水平的日粮。结果表明,不同Met水平、不同饲喂天数对IGF-Ⅰ、IGF-IR、EGF、BMP2、FGF-5、Kap3.1、Kap6.1、GHR、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3 等毛囊发育相关基因的表达量影响不同。高Met添加水平能降低饲喂40d时獭兔背皮中的BMP2基因表达水平;对KAPs基因表达进行检测发现,Kap3.1基因表达仅在饲喂60d时有显著变化,0.60%Met添加组Kap3.1表达量达到最高(P<0.05),而Kap6.1基因表达在不同的时间点变化与Kap3.1并不相同。对背皮中EGF基因表达检测发现,不同Met添加日粮饲喂60d时基因表达量有显著变化,0.30%和0.60%Met添加组EGF基因表达水平显著高于其他两组(P<0.05)。对TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3基因表达水平检测发现,适当的Met添加水平能降低獭兔背皮中TGFβ-1和TGFβ-3的基因表达水平。对GHR,IGF-Ⅰ,IGF-ⅠR基因表达规律分析发现,日粮Met对不同饲喂天数獭兔背皮中的GHR,IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因表达影响并未呈明显的一致性变化。6.Met对獭兔毛囊发育的影响及Wnt1Ob参与Met调控毛囊发育的机制初探试验发现,日粮不同Met水平饲喂断奶獭兔60d后,0.30%、0.60%和0.90%Met添加组的毛囊密度显著高于对照组毛囊密度,并且毛囊密度在0.60%添加水平时达到最高(P<0.05)。在体外培养的游离獭兔触须毛囊中加入Met,发现30mM、60 mM、90 mM、120mM、处理组的毛囊生长速度显著高于对照组和150mM、Met添加组(P<0.05),说明适当浓度的Met对毛囊的生长发育起到促进作用。对日粮不同Met水平饲喂獭兔背皮中Wnt1Ob、β-catenin总蛋白、磷酸化β-catenin蛋白和Dsh蛋白进行检测发现,随着不同Met水平日粮饲喂断奶獭兔时间的增加,獭兔背皮中Wnt1Ob、β-catenin总蛋白、磷酸化β-catenin以及Frizzled家族跨膜受体蛋白Dishevelled(Dsh)蛋白的表达呈现一定的规律性:适量的Met添加能提高Wnt1Ob及其相关通路蛋白的表达。这提示,Met对獭兔毛囊的促生长作用可能是通过调控Wnt经典即Wnt/β-连环蛋白信号通路来实现的。结论本研究发现,獭兔的毛囊发育呈周期性变化,Wnt1Ob表达与毛囊发育周期存在时空相关性,并证实其通过Wnt/β-catenin信号通路来发挥作用。并且发现Met能调控獭兔毛囊发育,其对毛囊的促生长作用可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路来实现的。