[目的]目前已有的体外扩增体系已经无法满足免疫细胞疗法日益发展的需求。如何通过优化常规扩增方法,提高体外扩增抗肿瘤免疫细胞的数量以及质量,成为当下免疫治疗研究中的热点问题。本课题拟研究天然产物——研究宝乐果粉对人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)活性的影响以及对体外扩增的Vγ9Vδ2-T细胞抗肿瘤活性的影响,并探究其可能的作用机制。[方法]取健康志愿者静脉血,使用密度梯度法分离PBMC,用不同浓度的宝乐果粉液对人PBMC干预处理,随后使用CCK-8法来检测宝乐果粉的细胞毒作用;再通过CCK-8法研究宝乐果粉联合IL-2对PBMC的影响;通过免疫磁珠阴选法,从新鲜分离的PBMC中富集出CD3~+T淋巴细胞,并用流式细胞仪检测其分选的纯度,同时检测了CD4~+T,CD8~+T淋巴细胞的百分率,通过加入CD3/CD28Dynabeads刺激CD3~+T淋巴细胞,通过加入不同浓度的宝乐果粉刺激CD3~+T淋巴细胞,72h后用流式细胞仪检测CD4~+T,CD8~+T淋巴细胞百分比的变化;另外,为了检测宝乐果果粉对人Vγ9Vδ2-T细胞的免疫调控功能,我们用帕米膦酸盐(Pamidronate,PAM)联合IL-2体外扩增PBMC中的Vγ9Vδ2-T细胞,并设置不同浓度的宝乐果粉对Vγ9Vδ2-T细胞的体外扩增进行干预。扩增期间中不同时间点,使用流式细胞仪检测Vγ9Vδ2-T细胞在体外扩增体系中的百分率以及细胞绝对数目;为了评估宝乐果果粉对Vγ9Vδ2-T细胞抗肿瘤活性功能的调控,我们将各组经不同浓度果粉培养的Vγ9Vδ2-T细胞与CFSE标记的K562按10:1效靶比共孵育6小时后,随后经PI染色,用流式细胞仪检测CFSE标记的K562细胞中PI~+所占的百分率,即为Vγ9Vδ2-T细胞杀伤K562的效率;为了深入研究宝乐果粉对Vγ9Vδ2-T细胞抗肿瘤活性调控的具体研究杀伤分子机制,我们将共在孵育后检测Vγ9Vδ2-T细胞的免疫表型及细胞因子分泌情况水平。[结果]宝乐果粉对人免疫细胞无毒性,且在浓度为10μg/mL时能够显著促进细胞增殖水平;使用10μg/mL宝乐果粉联合50IU/mL IL-2作用于PBMC,在第9天,IL-2处理组与10μg/mL宝乐果粉联合IL-2处理组,细胞增殖的水平具有显著差异;免疫磁珠法阴选分离出CD3~+T淋巴细胞,细胞纯度可高达99%。联合使用CD3/CD28抗体刺激的同时,并加入不同浓度的宝乐果粉对细胞进行处理,我们发现不同浓度宝乐果粉干预CD4~+T与CD8~+T淋巴细胞百分率无明显差异。但加了宝乐果粉的组别有CD8~+T淋巴细胞的百分比相对上调,CD4~+T淋巴细胞的百分率相对下调的趋势;PAM联合IL-2可用于体外扩增Vγ9Vδ2-T细胞;不同浓度的宝乐果粉培养Vγ9Vδ2-T细胞的过程发现,虽然Vγ9Vδ2-T细胞在扩增的百分率上没有差异,细胞绝对数量在扩增过程的前20天无明显差异,但扩增至第25天,第30天时,各处理组细胞数量均呈现下降趋势,但加入100μg/mL宝乐果粉培养的组别下降的趋势较慢,与对照组具有显著差异。用100μg/mL宝乐果粉处理Vγ9Vδ2-T细胞30天后,Vγ9Vδ2-T细胞与K562共孵育6h后,检测K562的死亡率,发现未使用宝乐果粉处理组中,Vγ9Vδ2-T细胞对K562的杀伤率为13.43%±1.8%,而使用宝乐果处理的Vγ9Vδ2-T细胞对K562的杀伤率为31.18%±3.6%,说明用宝乐果粉处理后K562靶细胞的死亡率提高了近18%;测宝乐果粉处理扩增30天后的Vγ9Vδ2-T细胞表面和胞内分子标志。我们发现宝乐果粉对Vγ9Vδ2-T细胞细胞表面分子TRAIL、FasL、NKG2D,以及胞内的溶解颗粒物质均无显著影响,但颗粒酶B表达升高,Fas表达降低;将经宝乐果粉处理的扩增30天后Vγ9Vδ2-T细胞纯化后与K562细胞按照1:1的比例共培养12h后,结果显示宝乐果粉处理组与PBS对照组相比较后,我们发现宝乐果粉处理组Vγ9Vδ2-T细胞分泌至细胞培养上清中的细胞效应因子的水平有显著性差异,比如,INF-γ、TNF-α、颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素以及颗粒溶解素(Granulysin)。[结论]宝乐果粉对人PBMC无细胞毒性,且在一定浓度范围可促进PBMC的体外增殖;宝乐果粉有促进CD3~+T淋巴细胞向CD8~+T淋巴细胞的方向分化的趋势;在100μg/mL宝乐果粉浓度作用下,Vγ9Vδ2-T细胞在体外培养的时间能够延长,且能通过分泌较高水平INF-γ、TNF-α、颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素以及颗粒溶解素等效应因子来增强其抗肿瘤活性。