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目的:本研究通过构建不同维生素A(vitamin A,VA)水平的孤独症大鼠模型,探讨孕期开始的维生素A缺乏(vitamin A deficiency,VAD)是否影响子代大鼠小脑浦肯野细胞的数量及树突形态,进而影响子代大鼠的运动协调功能,并且初步探索这其中可能涉及的分子机制。方法:构建丙戊酸(valproic acid,VPA)诱导的孤独症模型:选取8w成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,与普通成年雄鼠交配。在妊娠第12.5天,随机给予孕鼠VPA(600 mg/kg)或等量生理盐水腹腔注射,所产的雄性仔鼠分别为孤独症模型组(VPA组)和对照组(CON组)。合并VA缺乏(VAD)的孤独症模型的建立:选取3w雌性SD大鼠,随机分为VA正常(VA normal,VAN)和VAD组,分别给予VAN或VAD饲料喂养4周,取大鼠尾静脉血,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测血清VA浓度,选出VA水平正常(≥1.05μmol/L)和VA水平缺乏(<0.70μmol/L)的雌鼠,与普通成年雄鼠交配。在妊娠第12.5天,给予所有孕鼠腹腔注射600 mg/kg VPA。VAN组孕鼠所产雄性仔鼠为VAN+VPA组,始终接受VAN饲料喂养。VAD组孕鼠所产的雄性仔鼠被随机分成两组,VAD+VPA组和VAS+VPA组。VAD+VPA组大鼠始终接受VAD饲料喂养;VAS+VPA组大鼠生后换作VAN饲料喂养,在生后(postnatal day,PND)第1天开始灌胃补充VA1周。各组仔鼠于PND 28进行爬杆实验;于PND 35进行悬绳实验;于PND 42进行旷场实验;于PND 43进行三箱实验;于PND 46进行转棒实验。完成行为学实验后,于8w龄时将子代大鼠处死,收集血清和小脑组织,使用HPLC测定大鼠血清VA浓度;定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,q PCR)被用于定量分析大鼠小脑组织中RORα的m RNA表达水平;蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)检测小脑组织RARα和RORα蛋白表达水平;高尔基染色检测大鼠小脑浦肯野细胞树突形态;免疫荧光法和激光共聚焦检测RORα和Calbindin在大鼠小脑中的分布情况;通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)实验分析RARα与RORα基因的相互作用。双荧光素酶报告基因检测(dual-luciferase reporter assay)验证RARα对RORα的转录调控活性及结合区域。结果:(1)在旷场试验中,VPA组大鼠在自我梳理上花费的时间与CON组相比显著增多(P<0.05),而在中央区探索的时间显著少于CON组(P<0.05)。在三箱实验中,VPA组大鼠在陌生鼠箱中停留的时间显著低于CON组(P<0.05),但在玩具箱中停留的时间显著高于CON组(P<0.01),在中间箱停留的时间与CON组无显著差异(P>0.05)。在爬杆试验中,VPA组大鼠较CON组大鼠花费更多的时间爬至底座(P<0.05)。在悬绳试验中,VPA组大鼠从悬绳上掉落的时间显著低于CON组大鼠(P<0.01)。在转棒试验中,VPA组大鼠在转棒上停留的时间显著低于CON组大鼠(P<0.01)。免疫荧光的结果显示在小脑第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅹ小叶内,VPA大鼠的浦肯野细胞数目均显著低于CON组大鼠,改变最明显的是在第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅹ小叶(P<0.001)。高尔基染色的结果显示,在PND56,VPA组大鼠浦肯野神经元的树突面积与CON组相比显著降低(P<0.05);浦肯野神经元树突与同心圆的交点数在距离胞体100-130μm远处显著低于CON组(P<0.05)。与CON组相比,VPA组大鼠小脑RORα的m RNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。免疫荧光和激光共聚焦的实验证实VPA组的RORα与浦肯野神经元的特异性标记Calbindin在小脑存在共表达,并且这种共定位在VPA组也明显弱于CON组。(2)在PND1,PND7,PND14,PND28,PND42,PND56这几个时间点,VAD+VPA组大鼠的血清VA浓度均显著低于VAN+VPA组(P均<0.01);VAS+VPA组大鼠在PND1时血清VA浓度与VAD+VPA组没有显著差异,但与VAN+VPA组相比显著降低(P<0.01)。从PND7开始VAS+VPA组大鼠在各个时间点血清VA浓度均显著高于VAD+VPA组(P<0.01),与VAN+VPA组相比无显著差异(P>0.05)。在旷场试验中,VAD+VPA组大鼠在自我梳理上花费的时间与VAN+VPA组相比显著增加(P<0.01),在中央区探索的时间显著少于VAN+VPA组(P<0.001)。与VAD+VPA组相比,VAS+VPA组在自我梳理上花费的时间有显著减少(P<0.01),在中央区探索的时间显著增加(P<0.001)。与VAN+VPA组相比,VAS+VPA组在旷场试验中自我梳理时间和在中央区探索的时间均无显著差异(P>0.05)。在三箱实验中,VAD+VPA组大鼠在陌生鼠箱中停留的时间显著低于VAN+VPA组(P<0.01)但在玩具箱中停留的时间显著高于VAN+VPA组(P<0.01),在中间箱停留的时间与VAN+VPA组无显著差异(P>0.05)。与VAD+VPA组相比,VAS+VPA组在陌生鼠箱中停留的时间显著增加(P<0.01),而在玩具箱中停留的时间显著减少(P<0.01)。与VAN+VPA组相比,VAS+VPA组在各箱活动的时间无显著差异(P>0.05)。在爬杆试验中,VAD+VPA组大鼠较VAN+VPA组大鼠花费更多的时间爬至底座(P<0.05)。与VAD+VPA组相比,VAS+VPA组爬至底座的时间显著减少(P<0.05);与VAN+VPA组相比,VAS+VPA组爬至底座的时间无显著差异(P>0.05)。在悬绳试验中,VAD+VPA组大鼠从悬绳上掉落的时间显著低于VAN+VPA组(P<0.001)。与VAD+VPA组相比,VAS+VPA组大鼠从悬绳上掉落的时间显著增加P<0.001);与VAN+VPA组相比,VAS+VPA组从悬绳上掉落的时间无显著差异(P>0.05)。在转棒试验中,VAD+VPA组大鼠在转棒上停留的时间显著低于VAN+VPA组大鼠(P<0.05);与VAD+VPA组相比,VAS+VPA组大鼠在转棒上停留的时间显著增加(P<0.05);与VAN+VPA组相比,VAS+VPA组在转棒上停留的时间无显著差异(P>0.05)。免疫荧光的结果显示在小脑部分小叶中,VAD+VPA组的浦肯野细胞数量明显少于VAN+VPA组,包括小叶I(P<0.01)、Ⅳ(P<0.001)、Ⅴ(P<0.05)、Ⅵ(P<0.05)和Ⅶ(P<0.01)。在上述的这些小叶中,VAS+VPA组的浦肯野细胞数量较VAD+VPA组显著增加。VAN+VPA和VAS+VPA组在各小叶的浦肯野细胞数量没有显著差异(P>0.05)。高尔基染色的结果显示,在PND56,VAD+VPA组大鼠浦肯野神经元的树突面积与VAN+VPA组相比显著降低(P<0.05);与VAD+VPA组相比,VAS+VPA组大鼠浦肯野神经元的树突面积显著增加(P<0.05);与VAN+VPA组相比,VAS+VPA组大鼠浦肯野神经元的树突面积无显著差异(P>0.05)。VAD+VPA组大鼠浦肯野神经元树突与同心圆的交点数在距离胞体70-110μm远处显著低于VAN+VPA组和VAS+VPA组(P<0.05)。VAD+VPA组大鼠小脑组织RARα和RORα蛋白表达水平均显著低于VAN+VPA组和VAS+VPA组(P<0.05)。Ch IP实验结果显示:在大鼠小脑组织中,RARα与RORα基因的启动子区2号预测位点结合增强,与VAN+VPA组和VAS+VPA组相比,VAD+VPA组的这种结合显著降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测显示RARα对RORα基因具有转录活性。结论:(1)VPA诱导的孤独症模型大鼠运动协调能力下降,部分小脑小叶内浦肯野细胞数目减少,同时伴有树突发育受损,表现为浦肯野细胞树突面积下降,浦肯野细胞树突分支复杂程度下降。(2)孕期开始的VAD加重ASD模型大鼠的运动协调障碍和小脑损伤。生后早期补充VA可显著改善VAD的孤独症模型大鼠的运动协调障碍和小脑损伤。VAD加重ASD模型大鼠运动协调障碍可能是由于RARα在小脑的表达下降,RARα与RORα基因启动子区域结合减少所致。