【摘 要】
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Znf-bed3是一种新发现的蛋白,它具有锌指结构,可以与Axin相互作用从而正调控Wnt/β-catenin信号通路。其基因序列已经获得并插入pET28a质粒得到?72a质粒。为了获得高质量的晶
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Znf-bed3是一种新发现的蛋白,它具有锌指结构,可以与Axin相互作用从而正调控Wnt/β-catenin信号通路。其基因序列已经获得并插入pET28a质粒得到?72a质粒。为了获得高质量的晶体以确定Znf-bed3蛋白的结构,将Bed3基因于NdeⅠ和EcoRⅠ位点克隆入pET28c质粒,在BL21-CodonPlus(DE3)-RP菌株中表达目的蛋白,得到氨基端有组氨酸标签的Znf-bed3融合蛋白。超表达得到的Znf-bed3融合蛋白约占全菌蛋白的80%。由于融合蛋白有组氨酸标签,首先考虑使用镍柱对目的蛋白进行分离纯化,但是分离结果显示此方法对分离目的蛋白有一定的局限性。表达得到的目的蛋白有80%以上以包涵体形式存在,所以希望使用变复性方法处理包涵体以得到高纯度的目的蛋白。传统的盐酸胍变复性实验中,目的蛋白复性效率很低十分低(最高仅能达到10%),不适合用于进行目的蛋白的分离,所以必须探索新的纯化方案。由破菌一步开始进行,使用不同破菌液和变性剂进行破菌和包涵体洗涤条件的优化。实验中发现,30%醋酸破菌液能够很好的溶解包涵体,而且上清中目的蛋白相对
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