研究背景和目的目前研究认为,花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)是机体内多种重要的生物活性物质的前体。磷脂酶A2在各种生理性刺激作用下,脂解细胞膜磷脂释放出AA,AA被三种不同的酶途径进行代谢,即环氧化酶途径,脂氧化酶途径以及细胞色素P450表氧化酶途径。细胞色素P450(Cytochrome P450, CYP)表氧化酶代谢AA生成四种不同的环氧-二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids, EETs),分别为5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET与14,15-EET。可溶性表氧化水解酶(Soluble epoxide hydrolase,sEH)是代谢EETs的主要酶类之一,EETs经sEH代谢生成相应的二羟基-20碳三烯酸(Dihydroxyeicosatrienoic acids, DHET),其生物学活性明显减弱。许多研究证据表明CYP表氧化酶-EETs系统在心血管系统的稳态中发挥重要的生物学作用。EETs具有强大的舒张血管的功能,舒张血管的机制是通过激活BKCa2+引起血管平滑肌细胞超极化进而导致血管舒张,另外至少一部分是通过激活eNOS,促进NO释放发挥作用的；AA表氧化酶代谢产物EETs促进内皮细胞增殖与新生血管形成,其可能的机制是通过激活MAPK与PI3K／AKT信号通路,至少在一定程度上,eNOS／NO信号通路也发挥了重要的作用。EETs通过激活MAPK,PKC,PI3K／AKT信号通路上调内皮细胞eNOS的表达。CYP表氧化酶过表达,接下来增加EETs的生物合成,显著抑制了TNF-α诱导的内皮细胞凋亡,其可能的机制是通过抑制MAPK的去磷酸化,以及激活PI3K／AKT信号通路。EETs还具有抑制炎症保护血管内皮细胞的生物学功能。目前研究证明,应用sEH的特异性抑制剂抑制其生物活性后,sEH抑制剂对心血管系统与其他系统具有显著的保护作用,比如,舒张血管,降低血压；抑制高血压导致的肾脏损伤；抑制缺血诱导的脑损伤与血管损伤：抑制心肌缺血再灌注损伤：抑制心肌肥厚等等。糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是一种慢性进行性疾病,包括1型DM,2型DM,妊娠期糖尿病以及其他特殊类型的DM。在DM患者中90%以上为2型DM,其发病率逐年增加,其中体重增加和或肥胖是这类患者的突出表现,其主要病理生理问题是胰岛素抵抗(Insulin resistance, IR)和β细胞功能衰竭,并导致心脑血管系统和肾脏等多种严重并发症,甚至死亡,给家庭和社会带来沉重的经济负担。研究结果表明CYP表氧化酶,EETs与DHET在IR,脂肪酸β氧化与DM的发生机制中具有重要的作用。但是CYP2J3过表达能否改善胰岛素抵抗,提高外周组织对胰岛素的敏感性,能否保护胰岛β细胞功能,进而起到延缓2型糖尿病进展的作用,目前尚无文献报道。在本研究中,我们假设过表达CYP2J3基因,接下来EETs的产生增加,在改善IR,提高胰岛β细胞功能,延缓DM的进展中具有重要的保护作用。因此,在db／db 2型DM小鼠模型中,研究CYP2J3基因治疗对IR与DM的影响以及可能的分子机制,并在体外研究外源性EETs对NIT-1细胞增殖,胰岛素分泌能力,与抗损伤的影响以及可能的分子机制,旨在从整体动物水平和细胞水平明确CYP2J3-EETs系统是否能够改善胰岛素抵抗,提高外周组织对胰岛素的敏感性,以及是否能够保护胰岛β细胞功能,进一步明确CYP2J3-EETs系统是否能够延缓2型糖尿病的进展。一、体内实验细胞色素P450表氧化酶2J3基因过表达改善db／db 2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的作用及其机制实验目的：探讨CYP2J3基因过表达对db／db 2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响及其可能的分子机制。实验方法：1.pcDNA-2J3真核表达质粒的筛选与酶切鉴定：2.应用碱裂解法大量提取并应用硅土纯化法纯化pcDNA3.1与pcDNA-2J3真核表达质粒；3.实验动物适应性喂养1周后,随机分为6组,每组10只小鼠,分别为: C57BL／6组注射生理盐水,C57BL／6+pcDNA3.1组注射pcDNA3.1,C57BL／6+pcDNA-2J3组注射pcDNA-2J3,db／db组注射生理盐水,db／db+pcDNA3.1组注射pcDNA3.1,db／db+pcDNA-2J3组注射pcDNA-2J3。在实验开始前留取血标本及24小时尿标本,8AM至次日8AM代谢笼留取24小时尿。实验过程中每周称量实验动物的体重直至实验结束。所有的实验动物操作程序均符合NIH实验动物管理与使用指南,以及中国科学院实验动物管理规范所制定的标准；4.实验动物用小鼠固定器固定,经尾静脉注射导入目的基因pcDNA-2J3,对照基因pcDNA3.1与相同体积的生理盐水,每种质粒注射的剂量是5 mg/kg体重。基因导入2周后,测量24小时饮水量,留取24小时尿标本,进行腹腔注射葡萄糖耐量实验,该实验完成后处死动物,留取血液标本；取心脏,主动脉,胰腺,脂肪,肝脏,骨骼肌,肾脏等组织放入液氮冷冻后转入-80℃低温冰箱保存备用,同时以上部分组织标本放入甲醛溶液中固定,脱水浸腊石蜡包埋后室温保存备用；5.应用腹腔注射葡萄糖耐量的方法检测CYP2J3过表达对db／db 2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响；6.应用ELISA的方法检测小鼠血清胰岛素与尿中14,15-DHET的含量；应用相关的方法检测血清中血糖与血脂谱的浓度,并计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR；7.应用Western blot的方法检测db／db 2型糖尿病小鼠主动脉,心脏,肝脏以及肾脏中CYP2J3的表达；检测db／db与C57BL／6小鼠肝脏与骨骼肌中P-Y989-IRS-1,P-S307-IRS-1,PI3K,P-T308-AKT,P-S 1177-eNOS,P-T495-eNOS与P-T172-AMPK的表达。实验结果：1. Western blot检测结果显示,与注射pcDNA3.1的小鼠相比较,注射pcDNA-2J3的小鼠主动脉,心脏,肝脏,以及肾脏中CYP2J3的表达显著增加(P<0.05)；ELISA检测结果显示,C57BL／6+pcDNA-2J3(+)组14,15-DHET的含量是(38.68±2.86)ng/mL明显高于C57BL／6+pcDNA3.1组(6.32±1.12)ng/mL(P<0.05)；db／db+pcDNA-2J3组14,15-DHET的含量是(34.69±3.2)ng／mL明显高于db／db+pcDNA3.1组(5.48±1.98)ng/mL(P<0.05)。2.腹腔注射葡萄糖耐量实验结果显示,C57BL／6小鼠葡萄糖负荷之前空腹血糖的水平与葡萄糖负荷之后血糖的水平在多种基因治疗的处理中均无明显改变(P>0.05),与C57BL／6小鼠的血糖水平相比较,三组db／db小鼠的葡萄糖负荷之前空腹血糖的水平与葡萄糖负荷之后血糖的水平均显著升高(P<0.05)；然而,结果显示在0、30、60、120 min db／db+pcDNA-2J3组血糖浓度(12.65±1.14)mmol／L、(34.28±3.33)mmol／L、(19.01±3.23)mmol／L、(17.07±1.47)mmol／L明显低于db／db+pcDNA3.1组(18.78±1.92)mmol／L、(43.47±2.5)mmol／L、(27.73±1.36)mmol／L、(23.49±1.44)mmol／L(P<0.05)。与血糖的变化情况相似,C57BL／6小鼠葡萄糖负荷之前空腹胰岛素的水平与葡萄糖负荷之后胰岛素的水平在多种基因治疗的处理中均无明显改变(P>0.05),与C57BL／6小鼠的胰岛素水平相比较,三组db／db小鼠的葡萄糖负荷之前空腹胰岛素的水平与葡萄糖负荷之后胰岛素的水平均显著升高(P<0.05)；然而,实验结果显示在0、30、60、120 min db／db+pcDNA-2J3组血胰岛素浓度(1.43±0.36)ng／mL、(1.86±0.1)ng／mL、(2.09±0.322) ng/mL、(1.84±0.28)ng／mL明显低于db／db+pcDNA3.1组(2.5±0.27)ng／mL、(3.16±0.28)ng／mL、(3.40±0.287)ng／mL、(3.29±0.32)ng/mL,且差异有显著意义(P<0.05)。3.各种生化指标检测结果显示,三组C57BL／6小鼠各种生化指标,特别是糖脂代谢指标水平均无明显差异(P>0.05)。db／db小鼠的糖尿病表型特征很突出,具体表现为：血糖,血胰岛素,HOMA-IR,甘油三酯,胆固醇以及尿量的水平显著升高(P<0.05)。CYP2J3基因过表达显著降低了db／db小鼠的空腹血糖,空腹胰岛素,胰岛素抵抗指数以及尿量(P<0.05),然而,pcDNA3.1基因导入db／db小鼠体内对各种生化参数则无明显影响(P>0.05)。4. Western blot检测结果显示,与C57BL／6小鼠相比较,db／db组与db／db+pcDNA组小鼠肝脏与骨骼肌组织中P-Y989-IRS-1,PI3K,P-T172-AKT, P-S1177-eNOS与P-T172-AMPK的表达水平显著降低(P<0.05),而P-S307-IRS-1与P-T495-eNOS的表达水平显著升高(P<0.05)；在db／db小鼠体内过表达CYP2J3显著阻止了肝脏与骨骼肌中P-Y989-IRS-1,PI3K,P-T172-AKT,P-S1177-eNOS与P-T172-AMPK表达水平的降低(P<0.05),同时显著阻止了肝脏与骨骼肌中P-S307-IRS-1的表达水平的升高(P<0.05),而对肝脏与骨骼肌中P-T495-eNOS的表达水平无明显影响(P>0.05)。二、体外实验外源性EETs促进NIT-1细胞增殖与胰岛素分泌的作用及其机制实验目的：探讨外源性EETs对NIT-1细胞增殖与胰岛素分泌的影响及其可能的分子机制。实验方法：1.NIT-1细胞培养于含10%FBS的DMEM低糖培养基中,将NIT-1细胞放于37℃,含5%CO2的培养箱中培养。NIT-1细胞置于75 cm2培养瓶生长至90%汇合后0.25%胰蛋白酶消化传代,进行同步化处理,即当细胞生长至70%-80%汇合时,换含0.5%胎牛血清的低糖DMEM培养基饥饿培养12 h,换用无胎牛血清的低糖DMEM培养基,然后进行相应的干预处理；2.经过同步化处理的NIT-1细胞,应用SRB的方法检测EETs对NIT-1细胞活性的影响；3.经过同步化处理的NIT-1细胞,应用流式细胞仪检测EETs对NIT-1细胞周期的影响；4.经过同步化处理的NIT-1细胞,将MAPK,MEK,PI3K以及PPARγ的抑制剂Apigenin, PD98059, LY294002以及GW9662与NIT-1细胞以及14,15-EET共同孵育24 h后,应用SRB的方法检测EETs对NIT-1细胞活性的影响；5.EETs刺激NIT-1细胞1 h后,收集细胞并提取细胞蛋白质,应用Western blot方法检测NIT-1细胞中PI3K,P-T308-AKT,P-MAPK与PPARγ的表达。6.经过同步化处理的NIT-1细胞,随机分为Control组,Vehicle组,EET 10 nmol／L组,EET 50 nmol／L组以及EET 250 nmol／L组,每组设5复孔。分别将溶媒DMSO,8,9-EET,11,12-EET以及14,15-EET按照相应的浓度加入相应的孔中,孵育24 h,24h后去掉24孔板中的培养基,每孔加入1 ml的低糖KRBH溶液孵育1 h,去掉低糖KRBH溶液,每孔加入1 ml的高糖KRBH溶液继续孵育2 h,收集细胞上清液。应用ELISA的方法检测上清液中胰岛素的含量。7.经过同步化处理的NIT-1细胞,将MAPK,MEK,PI3K以及PPARγ的抑制剂Apigenin, PD98059, LY294002以及GW9662与NIT-1细胞以及14,15-EET共同孵育24 h后,去掉24孔板中的培养基,每孔加入1ml的低糖KRBH溶液孵育1h,去掉低糖KRBH溶液,每孔加入1ml的高糖KRBH溶液继续孵育2 h,收集细胞上清液。应用ELISA的方法检测上清液中胰岛素的含量。实验结果：1.8,9-EET,11,12-EET与14,15-EET均呈时间与剂量依赖性促进NIT-1细胞的增殖,MAPK抑制剂Apigenin, MEK抑制剂PD98059,PI3K抑制剂LY294002与PPARγ抑制剂GW9662显著抑制14,15-EET促进NIT-1细胞增殖的作用。2.8,9-EET,11,12-EET与14,15-EET显著促进了NIT-1细胞的分裂,表现为处于S期的细胞比例明显增多,S+G2／M期的细胞比例显著增加。对照组和溶媒组处于S+G2／M期的细胞比例分别为(37.3±0.7)%和(31.0±2.0)%,而8,9-EET,11,12-EET,14,15-EET分别为(43.0±1.1)%,(45.6±2.9)%和(45.3±1.8)%。3种EETs组处于S+G2／M期的细胞比例与溶媒组的差异具有统计学显著性意义(P<0.05)。3. Western blot检测结果显示,8,9-EET,11,12-EET与14,15-EET显著上调了NIT-1细胞P-MAPK,PI3K,P-AKT以及PPARγ的表达,提示EETs激活了MAPK,PI3K／AKT与PPARγ信号转导通路。4.ELISA检测结果显示,8,9-EET,11,12-EET与14,15-EET呈剂量依赖性显著促进了高糖负荷后胰岛素的分泌,而且不依赖于MAPK,PI3K／AKT与PPARγ信号转导通路的激活。三、体外实验外源性EETs抑制TNF-α诱导的NIT-1细胞凋亡的作用及其机制实验目的：探讨外源性EETs对TNF-α诱导的NIT-1细胞凋亡的影响及其可能的分子机制。实验方法：1.NIT-1细胞培养于含10%FBS的DMEM低糖培养基中,将NIT-1细胞放于37℃,含5%CO2的培养箱中培养。NIT-1细胞置于75 cm2培养瓶生长至90%汇合后0.25%胰蛋白酶消化传代,进行同步化处理,即当细胞生长至70%-80%汇合时,换含0.5%胎牛血.清的低糖DMEM培养基饥饿培养12h,换用无胎牛血.清的低糖DMEM培养基,然后进行相应的干预处理；2.经过同步化处理的NIT-1细胞,应用TNF-α诱导凋亡,应用流式细胞仪检测EETs对NIT-1细胞凋亡的影响；3.经过同步化处理的NIT-1细胞,应用TNF-α诱导凋亡,将MAPK,MEK,PI3K以及PPARγ的抑制剂Apigenin, PD98059, LY294002以及GW9662与NIT-1细胞以及14,15-EET共同孵育24 h后,应用流式细胞仪检测EETs对NIT-1细胞凋亡的影响；4.经过同步化处理的NIT-1细胞,应用TNF-α诱导凋亡,EETs与NIT-1细胞共同孵育24 h后,收集细胞并提取细胞蛋白质,应用Western blot的方法检测NIT-1细胞中Bcl-2,Bcl-XL,Bax,PI3K,P-T308-AKT与P-MAPK的表达；5.经过同步化处理的NIT-1细胞,应用TNF-α诱导凋亡,将MAPK,MEK,PI3K以及PPARγ的抑制剂Apigenin, PD98059, LY294002以及GW9662与NIT-1细胞以及14,15-EET共同孵育24 h后,收集细胞并提取细胞蛋白质,应用Western blot方法检测NIT-1细胞中Bcl-2,Bcl-XL与Bax的表达。实验结果：1.8,9-EET,11,12-EET与14,15-EET显著抑制了TNF-α诱导的NIT-1细胞的凋亡。结果显示,EETs使凋亡细胞的比例显著减少,对照组,PBS组,DMSO组和PBS+DMSO组凋亡细胞的比例分别为(18.33±1.45)%,(17.33±1.42)%,(29.3±1.72)%和(29.5±2.1)%；TNF-α组和TNF-α+DMSO组分别为(62.1±4.4)%和(77.0±3.1)%；而TNF-α+8,9-EET,TNF-α+11,12-EET和TNF-α+14,15-EET组分别为(37.7±1.1)%；,(50.7±4.8)%和(35.2±3.3)%。而且,TNF-α+8,9-EET,TNF-α+11,12-EET以及TNF-α+14,15-EET组凋亡细胞的比例与TNF-α组和TNF-α+DMSO组的差异具有统计学显著性意义(P<0.05)。2.MAPK抑制剂Apigenin, MEK抑制剂PD98059与PI3K抑制剂LY294002显著抑制14,15-EET抑制TNF-α诱导的NIT-1细胞凋亡的作用。结果显示,凋亡细胞的比例在DMSO组为(32.0±2.3)%,TNF-α组和TNF-α+DMSO组分别为(68.7±4.1)%和(78.3±2.6)%,TNF-α+14,15-EET组为(54.3±0.9)%,而TNF-α+14,15-EET+Apigenin组,TNF-α+14,15-EET+PD98059组,TNF-α+14,15-EET+LY294002组和TNF-α+14,15-EET+GW9662组分别为(65.1±2.5)%,(63.7±3.0)%,(64.0±3.5)%和(51.3±2.2)%,而且,TNF-α+14,15-EET+Apigenin组,TNF-α+14,15-EET+PD98059组,和TNF-α+14,15-EET+LY294002组凋亡细胞的比例与TNF-α+14,15-EET组的差异具有统计学显著性意义(P<0.05)。相反,TNF-α+14,15-EET+GW9662组凋亡细胞的比例与TNF-α+14,15-EET组的差异没有统计学显著性意义(P>0.05)。3. Western blot检测结果显示,TNF-α显著下调了NIT-1细胞Bcl-2,Bcl-XL,P-MAPK,PI3K与P-AKT的表达(P<0.05),显著上调了NIT-1细胞Bax的表达(P<0.05)。然而,8,9-EET,11,12-EET与14,15-EET显著抑制了TNF-α诱导的Bcl-2,Bcl-XL,P-MAPK,PI3K与P-AKT表达的下调(P<0.05),以及Bax表达的上调(P<0.05)。4. Western blot检测结果显示,MAPK,MEK与PI3K抑制剂Apigenin, PD98059与LY294002显著抑制了14,15-EET对NIT-1细胞Bcl-2与Bcl-XL表达水平的上调(P<0.05),以及Bax表达水平的下调(P<0.05),而PPARγ抑制剂GW9662对14,15-EET对NIT-1细胞Bcl-2与Bcl-XL表达水平的上调,以及Bax表达水平的下调无显著的影响(P>0.05)。统计学分析所有数据均以均数±标准误表示,应用SPSS13.0软件进行统计学分析,各分组组间差异采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异具有统计学显著性意义。结论1.CYP2J3基因成功的在C57BL／6与db／db小鼠体内表达,并发挥其生物学作用将花生四烯酸代谢为EETs。2.CYP2J3基因过表达改善了db／db 2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗,其分子机制可能是CYP2J3激活了IRS-1／PI3K／AKT／eNOS与AMPK信号通路,提示EETs是一种内源性的胰岛素增敏剂。3.外源性EETs通过激活MAPK与PI3K／AKT信号通路促进NIT-1细胞增殖与抑制TNF-α诱导的NIT-1细胞凋亡。4.外源性EETs促进了高糖负荷后NIT-1细胞胰岛素的分泌。5.CYP2J3-EETs系统通过改善胰岛素抵抗,提高外周组织对胰岛素的敏感性,保护胰岛β细胞的功能,最终延缓2型糖尿病的进展,起到治疗2型糖尿病的作用。6.本实验的研究结果为将来研究胰岛素抵抗与制定糖尿病的防治新策略,寻找新的药物作用靶点,开发新的治疗药物提供了新的研究方向和理论依据。