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背景:骨肉瘤是通常发生在儿童和青少年中的危及生命的癌症之一。全世界骨肉瘤的发病率约为每百万新发病例3至4。尽管外科手术和新辅助化疗已获得了很大的发展,但临床上仍有大部分患者预后较差,即使在规范化化疗和原发病灶的根治性切除后仍有局部复发或肺转移的高风险,对于转移性疾病或肿瘤复发的患者,临床结果则更差。随着医学进步和发展,人们对骨肉瘤的认识也逐渐深入。骨肉瘤的进展过程极其复杂,因此,阐述骨肉瘤发生发展的分子机制,在骨肉瘤中识别有效的诊断生物标志物或治疗靶点对早期诊断、避免化疗耐药、减少肺转移和提高临床预后具有重要意义。近年来已有研究发现环状RNA在中脑发育、帕金森病、阿尔兹海默病和肿瘤的发生发展具有密切的联系,但是,环状RNA表达的显著变化与骨肉瘤发生之间的关联尚未阐明。环状RNA是一类内源性RNA,其特点是具有共价闭环结构,无极性或多聚腺苷酸尾巴。与传统线性RNA相比,环状RNA没有自由末端因此并不能通用诸多经典RNA降解途径。环状RNA在体内可能具有更长的半衰期,这可能是源于这些分子的稳定性与不分裂特性。这使得环状RNA作为生物学标记来辅助诊断相关疾病成为可能。近年来,多项研究表明环状RNA的多种生物学功能与直肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤的生物学特性密切相关。最近发展起来的高通量测序可以对样本中所有表达的转录本进行捕获,RNA-seq的优点使得它对于注释新测序的基因组和检测基因注释不完整的物种的新基因和亚型来说非常重要。这类研究用于在环状RNA在骨肉瘤中的表达及其功能的研究较少。因此,我们运用高通量测序技术在3例骨肉瘤和3例正常骨组织中进行了环状RNA测序,构建了骨肉瘤的环状RNA表达谱,并对比计算出了骨肉瘤中的差异表达的环状RNA。在差异表达的环状RNA中,我们挑选了5个环状RNA用实时荧光定量PCR实验方法检测它们在10例骨肉瘤和正常骨组织中的相对表达量来验证高通量测序法获得的结果。通过对差异表达的环状RNA的生物信息学分析,推测其可能在疾病发生发展中的作用,从而为阐明骨肉瘤的分子生物学机制奠定一定的基础,为今后以环状RNA为切入点的骨肉瘤的诊断和治疗进行初步探索。目的:探索骨肉瘤和正常骨组织中环状RNA的表达谱。分析差异表达的环状RNA在骨肉瘤发生发展机制中可能的作用,为后续研究与骨肉瘤相关的环状RNA提供基础。方法:测序实验采用Illumina TruSeqTM Stranded Total RNA Library Prep Kit方法进行特异文库构建。在3个骨肉瘤患者的肿瘤组织和3个癌旁正常骨组织中提取总RNA,利用Nanodrop 2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,Agilent 2100测定RIN值并建立测序文库,将文库变性为单链DNA分子,原位扩增为簇,运用Illumina Hi Seq测序仪进行150循环的环状RNA测序,获取经过质控后的双端读段,用Tophat2软件将这些读段比对到参考基因组/转录组（Hg19）上,运用CIRCexplorer2软件行环状RNA检测和鉴定,并运用Ensembl gene,Known Genes gene,Ref Seq gene数据库对所鉴定的环状RNA进行注释。我们通过edge R软件包的quasi-likelihood F-tests方法进行差异表达分析,筛选两组配对组织中癌症组织-vs-癌旁组织之间的显著差异表达环状RNA,设定阈值为|log FC|>1,p value<0.01。在差异表达的环状RNA中,我们挑选了5个环状RNA用实时荧光定量PCR实验方法检测它们在两组标本间10个骨肉瘤患者的肿瘤组织和10个癌旁正常骨组织样本中的相对表达量,验证高通量分析得出的结果。对差异环状RNA宿主基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并用mi RNA靶基因预测软件Miranda进行环状RNA-mi RNA相互作用预测,使用Cytoscape软件构建环状RNA-mi RNA网络图。通过Dis Ge NET等数据库收集与骨肉瘤相关的mi RNA和基因。对于上步得到的骨肉瘤相关mi RNA和基因,我们通过mi RWlak数据库预测其之间是否存在调控关系,选择其中mi RWalk数据库、mi Randa数据库、Targetscan数据库共有的结果作为最终的mi RNA和基因的关系链。结合分析得到的环状RNA-mi RNA调控关系对以mi RNA为连接点进行整合,得到环状RNA与疾病相关mi RNA和基因的网络图。结果:在6个样本中,通过分析共鉴定出36631个环状RNA,对应8001个基因。通过聚类分析发现环状RNA在癌旁组织与骨肉瘤组织中表达模式存在显著差别。共259个差异表达环状RNA在两组组织中观察到,其中132个环状RNA在骨肉瘤患者肿瘤组织中上调表达,127个环状RNA在骨肉瘤患者肿瘤组织中下调表达。通过实时荧光定量PCR实验方法验证骨肉瘤中（人源）组织中的5个指标circ＿32279、circ＿24831、circ＿2137、circ＿6798、circ＿20403表达差异情况。与癌旁组织相比,在骨肉瘤组织中circ＿32279、circ＿24831显著性下调。circ＿2137、circ＿6798、circ＿20403显著性上调。对差异变化显著的环状RNA宿主基因进行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO分析显示在差异表达的环状RNA在生物学途径涉及了44个GO生物学途径（BP,Biological process）、19个GO细胞组份（CC,Cellular component）15个GO分子功能（MF,Molecular function）,共78个GO功能,KEGG通路分析发现差异表达的环状RNA一共有10个KEGG通路。研究发现一些环状RNA序列上存在mi RNA的多个靶点位置,从分析中我们得到与骨肉瘤相关11个mi RNA和44个基因。11个mi RNA中有6个mi RNA与我们高通量基因测序分析中的差异的环状RNA有相互作用关系。我们通过mi RWlak数据库预测其之间是否存在调控关系,选择其中mi RWalk数据库,mi Randa数据库,Targetscan数据库共有的结果作为最终的mi RNA和基因的关系链,共包括6个mi RNA和14个基因。结合常规分析得到的环状RNA-mi RNA调控关系对以mi RNA为连接点进行整合,得到环状RNA与疾病相关mi RNA和基因的网络图。结论:（1）在骨肉瘤组织和癌旁正常骨组织中存在着大量的环状RNA,相对于癌旁正常骨组织,大量的环状RNA在骨肉瘤组织中的表达出现了明显的上调或下调,这提示大量的环状RNA在骨肉瘤组织和癌旁正常骨组织中存在明显的表达差异。（2）调节表达的环状RNA的GO分析和KEGG通路分析显示他们可能参与了肌醇磷酸盐代谢、磷脂酰肌醇信号传导等多种与肿瘤相关的生物学过程,证明了环状RNA在骨肉瘤的发生和发展中起到了重要作用。（3）环状RNA-miRNA-基因网络图显示环状RNA与miRNA和基因之间有着极其复杂的调控关系,其在骨肉瘤患者肿瘤发生发展中的作用及其具体的调控机制有待进一步研究。