前言胃癌(Gastric cancer,GC)是一种发病率及死亡率均较高的消化系统恶性肿瘤,严重影响我国人民的健康寿命。胃癌早期就存在转移倾向,因此,超过百分之五十的患者发病时已被诊断为肿瘤晚期。虽然手术切除是胃癌治疗的主要方法,然而大多数患者在疾病诊断时就已经出现局部浸润及远处转移,丧失了手术机会,从而限制了手术方式的应用及治疗效果。全身化疗是局部复发以及晚期转移不可手术胃癌患者的首选方案,然而临床效果令人失望。研究表明化疗客观反应率仅达20～40%,中位总生存期(overall survival,OS)只有6～11个月。而且.目前临床治疗上也缺乏标准化疗方案,所以患者生存情况并不乐观。为此,近年来,研究人员致力于发现新的胃癌特异性生物标志并探索新的临床治疗手段,以提高胃癌的早诊率,改善胃癌患者的预后。在肿瘤生物学领域,分子靶向治疗引起广泛关注,以提高抗癌疗效的特异性,降低耐药性和非选择的毒性。目前已开展多个针对胃癌分子靶向治疗作用机制临床试验,如表皮生长因子、胰岛素样生长因了受体、c-Met、细胞周期、细胞凋亡、关键酶、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路以及调节血管生成、免疫检查点阻断等。曲妥珠单.克隆抗体是最先被批准用于胃癌标准治疗分子靶向药。ToGA临床实验表明,曲妥珠单抗与全身化疗联合可改善人类表皮生长因子受体(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER-2)阳性表达晚期胃癌患者生存期,共同治疗效果显著优于单纯化疗。然而HER-2标记在胃癌患者表达率及扩增数很低,仅为6～23%,限制了其临床治疗应用。2014年4月,基于RAINBOW临床试验的结果,人血管内皮生长因子受体2拮抗剂ramucirumab被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)审批上市,与化疗联合治疗二线或一线化疗失败进展期胃癌及胃食管结合部腺癌。我国自主研发的抗血管生成小分子酪氨酸酶抑制剂甲磺酸阿帕替尼可显著改善二线化疗失败晚期胃腺癌患者总生存期(OS)。除此之外,其他许多针对胃癌的靶向药物均未取得令人满意的临床治疗效果。Stathmin是一种广泛存在于细胞内的细胞信号转导分子,作为参与微管(microtubule,MT)聚合的关键蛋白之一,在有丝分裂过程及其他各种生命活动中起着至关重要的作用。通过其自身位点的磷酸化和去磷酸化,影响微管系统的动力学稳定性,调控细胞周期,最终导致细胞的生物学行为发生变化。Stathmin表达受许多转录因子、激酶以及磷酸化酶等调节与控制,通过调节恶性肿瘤细胞微管动力学、细胞增殖、活性以及凋亡等过程,对恶性肿瘤发生、发展、分子诊断及疗效预后预测等方面均具有重要意义。近年来的研究发现:Stathmin于多种肿瘤组织中过表达,跟恶性肿瘤的分化程度、淋巴结转移情况、疾病TNM分期及临床预后具有显著关联。在前期研究工作中,我们初步检测了 2种胃癌细胞系(SGC7901和MGC803)、8例胃癌患者术后切除肿瘤组织以及癌旁正常组织中Stathmin表达情况,结果表明Stathmin在2种胃癌细胞系及胃癌组织均有高表达,而于癌旁组织中仅呈弱阳性或不表达。提示Stathmin在胃癌细胞分化、增殖进程中可能发挥重要意义和作用。桔抗或阻断Stathmin可影响肿瘤细胞的有丝分裂、生长、转移、存活和肿瘤克隆形成、细胞周期受阻于G2/M期以及凋亡率增加。Stathmin水平异常升高与微管依赖过程密切相关,影响以微管蛋白为作用靶点的化疗药物疗效,从而可能导致肿瘤细胞耐药。考虑抗Stathmin治疗与多西他赛两者均以微管通路作为药物靶点,我们推测两者的联合应用可能具有协同抗肿瘤作用。阻断Stathmin表达及抑制其生物学功能将可能成为一种癌症治疗方式。迄今为止,尚未有针对Stathmin与胃癌发生发展相关性及诊治影响的系统研究。Stathmin在胃癌肿瘤进程中所起到的介导功能及内在的作用机制尚不清楚。基于前期试验结果,我们拟通过检测胃癌患者肿瘤组织标本及癌旁正常组织标本Stathmin表达水平,研究其与胃癌临床诊断、治疗以及预后因素之间关联性,以期为胃癌分子标志物筛选提供思路;分析其与化疗敏感性及生存率的相关性,有助于临床指导胃癌化疗药物的选择及预后的判断;通过体外和体内试验验证 Stathmin 反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对胃癌细胞生长、凋亡影响;明确Stathmin抑制剂和化疗药物多西他赛对胃癌细胞增殖协同治疗疗效。本研究将为胃癌的诊疗策略提供更充分的临床证据,探寻胃癌治疗的潜在的分子标记物和靶点。第一部分Stathmin在胃癌组织表达的意义及其与化疗疗效、预后的相关性目的1.应用免疫组化、Western Blot方法检测Stathmin在人胃癌组织及癌旁正常组织中的表达情况;2.研究Stathmin表达与胃癌患者肿瘤细胞分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况等临床特征的关系,以期为胃癌分子标志物的筛选提供思路;3.探讨Stathmin表达与化疗药物有效性及胃癌患者生存率的相关性,为临床指导胃癌患者化疗药物的选择及预后的判断提供依据。材料与方法本实验纳入山东省千佛山医院2009年1月至2009年12月进行手术切除治疗(根治术、姑息性切除术)或组织活检并经病理明确诊断的胃腺癌患者56例,分别取其胃癌组织标本及其癌旁组织标本,所有患者诊断前均未接受放疗、化疗及微创治疗,所有病理切片均遵照全国胃癌协作组标准诊断并由病理科医师进行复检。采用免疫组化、Western Blot方法检测胃癌及癌旁组织中Stathmin表达水平;研究其表达与胃癌临床诊治、预后等相关生物学特征的关系;通过探索Stathmin表达水平与DC(多西他赛和顺铂)方案化疗的有效率、临床受益率、1年及3年生存率等相关性研究,为个体化治疗方案的制定提供依据。结果:1.Stathmin在胃癌组织及癌旁组织中的表达免疫组化结果示Stathmin阳性显色颗粒呈棕黄色或褐色,癌组织区域内大多数细胞呈阳性染色反应,但在癌旁标本中的表达则明显减弱。此外,我们还通过western blot法检测了胃癌及癌旁正常组织中Stathmin的表达水平。Stathmin蛋白的表达水平在肿瘤组织中明显增高。在所有标本中,癌组织中Stathmin蛋白的阳性表达率为71.4%,而癌旁组织的表达率仅为37.5%(P<0.05)。2.Stathmin表达与胃癌的临床病理资料分析通过分析Stathmin表达与胃癌的临床病理资料,Stathmin表达与肿瘤细胞分化程度(P<0.001)、肿瘤浸润深度(P<O.001)、淋巴结转移(P<0.001)均正相关,而与性别(P>0.05)及年龄(P>0.05)无关。3.Stathmin与化疗疗效及预后分析Stathmin阳性表达组的化疗有效率、临床获益率分别为10.5%、52.6%,均低于阴性表达组23.1%、69.2%,差异具有统计学意义(有效率P=0.022,临床获益率P=0.020,均<0.05)。对两组患者进行随访1年、3年发现,两组1年生存率、3年生存率均无显著性差异(P均>0.05)。结论:Stathmin蛋白在胃癌组织中的阳性表达率较癌旁正常组织明显升·高。Stathmin蛋白表达与肿瘤分化程度及肿瘤TNM临床分期等预后指标均正相关,而与性别及年龄无明显相关性。Stathmin阳性表达组的化疗疗效、临床获益率均降低,但对生存率及生存期无明显影响。Stathmin的表达水平将是胃癌预后分子标志物之一,可作为化疗疗效评估的一个参考指标。第二部分Stathmin基因反义核酸对胃癌细胞生长、成瘤的作用研究目的:1.体外实验研究StathminASODN对胃癌细胞系生长和凋亡过程的作用机制。2.动物实验研究Stathmin ASODN对荷瘤小鼠的肿瘤生长的抑制作用。3.体外实验评估StathminASODN联合多西他赛对胃癌细胞生长调控的作用机制。材料方法:1.采用 StathminASODN 及正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide,SODN)转染胃癌SGC 7901细胞。2.RT-PCR方法检测ASODN转染细胞、SODN转染细胞及对照组未转染细胞的StathminmRNA表达水平。Western blot方法检测Stathmin蛋白的表达水平。3.MTT法检测SGC 7901细胞的增殖能力。4.观察StathminASODN、SODN处理的SGC 7901细胞,以及未经转染肿瘤细胞的细胞倍增时间的差异。5.应用流式细胞术分析抗Stathmin治疗对胃癌细胞凋亡的影响。6.观察StathminASODN、SODN转染的裸鼠胃癌移植瘤的生长情况、测量瘤径。结果:1.StathminASODN对体外培养的人胃癌SGC 7901细胞系增殖的影响采用ASODN及SODN转染人胃癌SGC 7901细胞。在转染72 h之后,采用RT-PCR检测ASODN转染细胞、SODN转染细胞及对照组未转染细胞的 StathminmRNA 表达,分别为 0.21±0.08、1.01±0.43 和 1.44±0.54。ASODN和SODN转染组表达水平两者之间存在显著差异(P<0.01)。Western blot方法检测结果示:与SODN转染组比较,ASODN转染细胞组的Stathmin蛋白水平下降。MTT结果显示:与SODN治疗组相比,不同浓度Stathmin ASODN组SGC 7901细胞的增殖均被显著抑制(P<0.05);该抑制作用在72小时达到高峰,最佳治疗浓度为20μmol/L;细胞倍增时间延长。流式细胞术检测显示:Stathmin ASODN组早期凋亡细胞增多,凋亡率增加。2.StathminASODN对荷瘤小鼠胃癌移植瘤生长的影响Stathm in AS ODN转染的裸鼠胃癌移植瘤生长速度较对照组明显减缓。StathminASODN转染裸鼠的肿瘤大小(平均直径)为4.04±0.17mm3,显著低于SODN组(8.01 ±0.21 mm3),两组具有统计学显著性差异(P<0.05)。3.StathminASODN和多西他赛联合治疗对人胃癌SGC 7901细胞增殖的影响多西他赛可以抑制SGC 7901细胞的增殖,并呈剂量依赖性和时间依赖性。与StathminASODN联合处理细胞时,对细胞增殖活性的抑制作用更为显著,因此两者的联合治疗明显优于多西他赛单独处理组(P<0.05)。结论:1.体外和体内实验证实Stathmin ASODN显著抑制胃癌细胞的增殖,Stathmin可能是胃癌治疗的一个潜在分子标志物和靶点。2.StathminASODN增强多西他赛对胃癌细胞增殖的抑制作用,表明两者联合治疗的协同效果,提示抗Stathmin靶向治疗与化疗具有协同抗肿瘤治疗作用,联合治疗的临床获益更大。