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蓝藻产生的微囊藻毒素（MCs）是一类小分子生物毒素,可造成水体、土壤环境以及农产品和食品的污染。已报道的MCs超过200种,其中MC-LR亚型毒性最强、危害最普遍,属2B类致癌物,世界卫生组织规定其在饮用水中的最大残留限量为1.0μg/L。探寻MCs快速高灵敏监测方法,一直是业内探索的热点。本研究借助噬菌体展示抗体库,以及抗体高通量筛选与特性修饰等技术手段,用多种渠道研制了具有MC-LR高灵敏结合能力的异源基因工程抗体（GEAb）,并建立了相应免疫学分析方法用于其快速高灵敏检测,具体研究的内容如下:（一）MC-LR驼源纳米抗体筛选与应用。将MC-LR偶联到KLH和BSA上,形成MC-LR-KLH和MC-LR-BSA复合物,分别作为富集和筛选的包被抗原,经4轮富集淘筛,从驼源噬菌体纳米抗体库中获得20个阳性克隆。阳性反应最强的ANAb12,ANAb9和ANAb7基因被克隆到p ET26b（+）载体上,并导入E.coli BL21中进行可溶性表达。以获得的ANAb12,ANAb9和ANAb7纳米抗体蛋白建立IC-ELISAs测定MC-LR,结果显示,它们的最低检出限分别达到0.06,0.08和0.12μg/L;经MC-LR同系物交叉反应分析,3个纳米抗体对MC-RR,MC-YR和MC-WR均具有较强识别能力,交叉反应率达到82.7%～116.9%。上述IC-ELISAs对MC-LR在自来水中的添加回收测试,回收率为84.0%～106.5%,变异系数为3.4%～10.6%,表明检测方法具有良好的精确性和稳定性。（二）MC-LR免疫兔源抗体库构建及其sc Fv筛选与应用。以MC-LR-KLH为免疫原,经5轮免疫,供试兔血清滴度达到1:2500000。以兔脾脏总RNA反转录的c DNA为模板,设计特异性引物分别扩VH、VL基因进而拼接成为sc Fv基因,经克隆到p IT2噬菌粒载体上并转入E.coli TG1中,成功构建库容量为3.26×109 cfu/m L的MC-LR免疫兔源噬菌体sc Fv库。以MC-LR-BSA为包被抗原,经4轮富集淘筛,从库中获得18个阳性克隆。将阳性反应最强的Rsc Fv3基因导入E.coli HB2151中进行可溶性表达制备其sc Fv蛋白。以获得的MC-LR p Abs和MC-LR Rsc Fv3-sc Fv蛋白建立IC-ELISAs测定MC-LR,结果显示,它们的最低检出限分别达到0.03和0.05μg/L;经MC-LR同系物交叉反应分析,两种抗体对MC-RR,MC-WR和MC-YR均具有较强识别能力,交叉反应率达到56%～136%。以MC-LR Rsc Fv3-sc Fv蛋白建立的IC-ELISA对MC-LR在自来水、瓶装饮用水和湖水样品中的添加回收测试,回收率为86.8%～106%,变异系数为1.8%～10.8%,表明检测方法具有良好的精确性和稳定性。（三）MC-LR免疫鼠源抗体库构建及其sc Fv筛选与应用。以MC-LR-BSA为免疫原,经5轮免疫,供试小鼠血清滴度达到1:3600000。以鼠脾脏总RNA反转录的c DNA为模板,设计特异性引物分别扩增VH、VL基因进而拼接成为sc Fv基因,经克隆到p IT2噬菌粒载体上并转入E.coli TG1中,成功构建库容量为8.67×107 cfu/m L的MC-LR免疫鼠源噬菌体抗体库。以MC-LR-KLH为包被抗原,经4轮富集淘筛,从库中获得16个阳性克隆。将阳性反应最强的Msc Fv7基因导入E.coli HB2151中进行可溶性表达制备其Msc Fv-sc Fv蛋白。以Msc Fv7-sc Fv蛋白建立IC-ELISA检测MC-LR,结果显示,它的最低检出限达到0.044μg/L;经MC-LR同系物交叉反应分析,其对MC-RR和MC-YR均具有较强识别能力,交叉反应率分别为85.9%和93.1%。该IC-ELISA对MC-LR在自来水、瓶装饮用水和湖水样品中的添加回收测试,回收率为81.2%～106.3%,变异系数为2.62%～10.22%,表明检测方法具有良好的精确性和稳定性。（四）MC-LR AVHH-MVH重组及其活性修饰与应用。为了获得结合活性和热稳定性更高的MC-LR GEAb,以ANAb12和Msc Fv7为模板,借助链置换技术,将两者重链区域（VH）拼接形成AVHH-MVH重组抗体,经ELISA测定,其对MC-LR的结合活性和热稳定性分别比ANAb12和Msc Fv7均有所提高。为了进一步改进AVHH-MVH的抗原结合活性,对其MVH-CDR3区域进行了定点突变,成功构建库容量为8.99×105 cfu/m L的噬菌体展示AVHH-MVH突变抗体库。以MC-LR-KLH为包被抗原,经3轮富集淘筛,从突变库中获得15个阳性突变克隆,其中5个反应值高于原初AVHH-MVH。将阳性反应最强的mutant 3基因克隆到p ET25b（+）载体上,并转入E.coli Rosetta中进行可溶性表达制备AVHH-MVHmutant3蛋白。以获得的AVHH-MVH mutant3蛋白建立IC-ELISA测定MC-LR,结果显示,它的最低检出限达到0.0075μg/L,比ANAb12和Msc Fv7分别提高了5.86倍和8倍;经MC-LR同系物交叉反应分析,其对MC-RR和MC-YR均具有较强识别能力,交叉反应率分别为90.2%和122.5%。该IC-ELISA对MC-LR在自来水、瓶装饮用水和湖水样品中的添加回收测试,回收率为82.68%～99.25%,变异系数为2.64%～10.85%,表明检测方法具有良好的精确性和稳定性。综上所述,本研究通过设计不同筛选路径,分别从商品化天然抗体库、自构建兔/鼠免疫抗体库和优质GEAbs模板定点突变抗体库中成功获得了涵盖驼源纳米抗体、兔源sc Fv、鼠源sc Fv以及双重链AVHH-MVH重组抗体在内的异源GEAbs材料70个,为MC-LR免疫学检测研究储备了丰富的优质GEAbs资源。特别是依托代表性的高活性GEAbs建立的IC-ELISAs,对MC-LR的检测灵敏度均远低于其在饮用水中的最大残留限量标准,这些检测方法具有良好的实用性,有望为饮用水、土壤环境以及农产品、食品的风险评估和安全预警提供精确的测定手段。