寄生虫病特别是寄生性线虫病目前依然是严重危害畜牧业发展的大敌。对这类病原生物的防治主要依靠抗蠕虫化学药物,但化学驱虫药物不可避免地产生了抗药性、药物残留和生态环境污染三个方面的问题。为了解决化学驱虫药物防治家畜寄生性线虫病所带来的上述弊端,促进畜牧业的可持续发展,需要寻求新的家畜线虫病防治方法。目前,研究最多、最深入且最有应用前景的就是利用寄生性线虫的自然天敌-捕食线虫性真菌进行生物防治。但要想很好达到实际应用捕食线虫性真菌的目的,首先必须弄清这类真菌发挥作用的详细过程和生化机制问题,为此本课题主要进行了以下相关研究:(1)将秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)作为实验动物模型,引入了对捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)捕食过程的观察研究。结果表明:秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)在1～2h内即可诱导-少孢节丛孢菌产生捕食器,且最快可于加入虫体后的2h将线虫虫体捕获,捕食器同虫体接触部位的菌丝比未接触处的菌丝粗大,而且表面粗糙似有粘液性物质存在;在捕食性菌环细胞的边缘存在大量大小不均的电子致密体。真菌捕食器同虫体的接触部位多集中在虫体的头部和尾部,表明在这些部位存在某些特异性的作用位点;在线虫和真菌菌环接触部位的表皮有明显的凹陷,说明在捕食的开始阶段机械力的作用确实存在;真菌在穿透线虫体壁后先是形成侵染球,继而再由侵染球发育为菌丝,在此过程中线虫内容物发生降解,菌丝逐渐充满整个虫体内腔,虫体最终崩解消失。(2)通过对捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)生长所需最佳碳源、氮源、碳氮比值及培养基初始pH值的优化,发现在固体培养基上,蔗糖和L-谷氨酸是最好的碳氮源;在pH值为6.8的固体培养基中,对菌丝生长最适合的碳氮比值为5:1;最适合菌丝生长的pH值范围是7.0～8.5。在液体培养基中,玉米粉和硫酸铵对于菌丝生长是最优的碳氮源;对pH值为6.8的液体培养基来说,最佳的碳氮比值为10:1;最适合的pH值范围是5.5～6.0。(3)采用多种氨基酸在固体CMA培养基上对少孢节丛孢菌(A.oligospora)捕食器诱导效力进行了试验,发现加入一定浓度某些种类的氨基酸后,可以诱导少孢节丛孢菌产生捕食器,并能捕食线虫幼虫;并且不同种类氨基酸对少孢节丛孢菌产生捕食器的影响不同,其中以浓度为0.05g/L的L-苯丙氨酸、L-蛋氨酸、DL-缬氨酸的诱导效果较好;L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸属于中等;L-赖氨酸、L-谷氨酸和L-组氨酸溶液表现较差。生长初期和中期加入氨基酸的试验组捕食器产生良好,且前者明显好于后者。说明氨基酸主要刺激新生菌丝产生捕食器。(4)通过分析含捕食器菌丝、普通营养菌丝和寄生性线虫第3期幼虫的生化组分发现:少孢节丛孢菌捕食器(菌环和菌网)粗蛋白质和各种氨基酸的含量大多数都高于分生孢子和普通营养菌丝,但小于线虫幼虫的含量;进一步研究发现含捕食器菌丝中含有一些普通营养菌丝所不具有的蛋白质,且前者的蛋白酶水解活力也明显大于普通营养菌丝;此外,普通营养菌丝总糖的含量为30.69%,高于含捕食器菌丝(菌环和菌网)24.77%的总糖含量。这表明捕食器菌丝的化学组成与普通营养菌丝是不一样的,普通营养菌丝在变成捕食器时,蛋白质、总糖及氨基酸等生化组分的含量均发生了改变。(5)优化了少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物提取的方法,研究了某些化学试剂、酶和蛋白酶抑制剂对真菌生长和捕食作用的影响,初步了解了存在于捕食器表面并参与捕食过程的物质种类及其作用,证实了表面聚合物在黏附线虫时具有重要作用,而且这些物质主要为蛋白质或含蛋白质的化合物;同时还首次在含捕食器菌丝提取到的表面聚合物中,检测到了蛋白酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性,且其活性显著高于普通营养菌丝,间接证实了上述酶类物质可能在捕食过程中起关键作用。(6)通过研究不同诱导剂物质和不同营养组成的液体培养基中培养的少孢节丛孢菌发酵液后,发现培养基的组成成份和相关诱导剂能够显著影响少孢节丛孢菌的代谢过程;而且秀丽新杆线虫刺激产生的培养基滤液和氨基酸刺激产生的培养滤液内所含成分不同;蛋白酶活性越高的滤液中,磷酸酶活性越低。并且从秀丽新杆线虫作刺激物的液体培养基LMZ培养液中纯化到一种丝氨酸蛋白酶,分子量约为38KDa左右,最适pH值范围和最适温度分别为pH6～8.5和50℃。这种丝氨酸蛋白酶的纯化为阐明捕食性真菌对线虫的捕食机理和捕食作用提供了重要资料。(7)扩增并分析了少孢节丛孢菌内蒙古株(A. oligospora CHIM)胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的序列,所得序列全长为1108bp,在片段中含有BstXI、DraII、EcoRI、SacI、SalI和XbaI 6种限制性内切酶酶切位点;少孢节丛孢菌CHIM株丝氨酸蛋白酶基因与同种国外分离株和云南株的同源性分别为80.3%和84.1%;根据核苷酸推导的氨基酸序列同GenBank中发表的相应氨基酸序列的同源性为100%。在线Blastn分析,证实我们扩增所得的片断是少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶编码基因的部分序列。又一次证实捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌存在不同国家、地区株的差异。