茯苓化学成分及质量控制方法研究

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本论文分为三个部分:第一部分文献综述茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核。性平,味甘、淡,归心、肺、脾、肾经,功效利水渗湿、健脾、宁心安神。用于水肿尿少、痰饮眩悸,脾虚食少,便溏泄泻,心神不安,惊悸失眠等症。本论文共查阅138篇相关文献,对茯苓的化学成分、药理作用及质量控制现状进行了综述,归纳了目前已报道的茯苓多糖24个、三萜类化合物83个。此外,茯苓中还含有甾体类、挥发性成分、脂肪酸和氨基酸等成分。在药理活性方面,分别总结了茯苓两大主要成分——多糖和三萜的活性,二者均具有调节免疫、抗肿瘤、抗炎、保肝等多方面作用,在临床上应用广泛。质量控制方面,目前主要集中在有效成分的含量及药材的指纹图谱研究。第二部分茯苓化学成分研究采用色谱法对中药茯苓的化学成分进行了分离纯化,分离得到4个化合物。通过理化方法、色谱及波谱方法鉴定了4个化合物,分别为:橙皮苷(hesperidin)、原儿茶酸(protocatechuic acid)、孕甾-7-烯-2p,3a,15a,20(S)-四醇(pregn-7-ene-2β,3a,15a,20(S)-tetrol)、苯丙氨酸(phenylalanine)。其中橙皮苷、原儿茶酸和苯丙氨酸3个化合物为首次从茯苓属中分离得到。第三部分茯苓药材质量控制方法研究建立了15个不同产地茯苓药材的HPLC指纹图谱,作为控制药材质量的定性指标。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对15个不同产地茯苓药材的指纹图谱进行了相似度分析,标定出19个色谱峰为共有峰,15批药材的相似度在0.985-0.860之间,其中10批药材的相似度在0.90以上,6批药材的相似度在0.95以上。聚类结果显示,15批药材聚为3类,没有显著的地域性特征。在主成分分析中,提取了6个主成分,累计贡献率为91.647%,其中第一主成分贡献率为31.869%。19个共有峰中对第一主成分贡献率最大的5个色谱峰分别为6,13,4,7,15号峰,鉴定为化合物6a-羟基去氢茯苓酸、3-表去氢土莫酸、3-酮基-16a,25-二羟基-羊毛甾-7,9(11),24(31)-三烯-21-酸、3-酮基-6,16a-二羟基-羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21-酸、去氢茯苓酸,这5个化学成分的含量对不同产地茯苓药材的质量影响最大,可能也是影响药材聚类结果的主要原因。采用HPLC/MSn对茯苓药材指纹图谱的共有峰进行定性归属,鉴定了19个共有峰中的17个,分别是:29-羟基去氢土莫酸(色谱峰1)、5a,8a-过氧化去氢土莫酸(色谱峰2)、6a-羟基猪苓酸C(色谱峰3)、3-酮基-16a,25-二羟基-羊毛甾-7,9(11),24(31)-三烯-21-酸(色谱峰4)、3p,16a-二羟基-羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21-酸(色谱峰5)、6a-羟基去氢茯苓酸(色谱峰6)、3-酮基-6,16α-二羟基-羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21-酸(色谱峰7)、去氢土莫酸(色谱峰8)、3-酮基-6,16a-二羟基-羊毛甾-8,24二烯-21-酸(色谱峰10)、猪苓酸C(色谱峰12)、3-表去氢土莫酸(色谱峰13)、3β-羟基-16α-乙酰氧基-羊毛甾-7,9(11),24(31)-三烯-21-酸(色谱峰14)、去氢茯苓酸(色谱峰15)、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸(色谱峰16)、3-表去氢茯苓酸(色谱峰17)、3β-对羟基苯甲酰基-去氢土莫酸(色谱峰18)、去氢依布里酸(色谱峰19)。此外,离子流图中还显示了4个仅有末端吸收的色谱峰,经解析鉴定其中3个为16α-羟基-3-氢化松苓酸(色谱峰a1)、土莫酸(色谱峰a2)、茯苓酸(色谱峰a4)。指纹图谱共有峰的定性归属,可以为不同产地茯苓药材的质量控制提供依据。首次建立了测定茯苓中茯苓酸和去氢依布里酸含量的HPLC方法,并测定和比较了15个不同产地药材中2种成分的含量。茯苓酸、去氢依布里酸的回归方程分别为Y=49140X+75835(r=0.9994)、Y591020X-6847.4(r=0.9996),茯苓酸和去氢依布里酸分别在0.424μg-3.392μg、0.0458μg-0.458μg范围内成线性。茯苓酸和去氢依布里酸的平均加样回收率分别为101.85%、100.95%,RSD分别为2.43%和1.58%。15批茯苓药材中茯苓酸和去氢依布里酸的含量测定结果表明,该方法简便、快速、可靠且重现性好,可作为茯苓药材中茯苓酸和去氢依布里酸的含量测定方法。创新点:1.从茯苓的非多糖水提部位分离鉴定了4个化合物,即:橙皮苷、孕甾-7-烯-2β,3α,15α,20(S)-四醇、原儿茶酸、苯丙氨酸。其中橙皮苷、原儿茶酸和苯丙氨酸3个化合物为首次从茯苓属中分离得到。2.首次建立了茯苓药材中茯苓酸和去氢依布里酸的HPLC含量测定方法,并对15个不同产地茯苓药材中2个成分的含量进行了测定和比较,为不同产地茯苓药材的质量控制提供依据。
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