蝉拟青霉产透明质酸的提取工艺及其性质研究

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透明质酸(Hyaluronic acid, HA)又名玻璃酸,因其独特的分子结构和理化性质而具有高粘弹性和强力的保水作用,极具实用价值。本试验重点针对蝉拟青霉发酵液中提取透明质酸的提取工艺进行优化研究,使用比较几种常用的发酵液处理方法,得出蝉拟青霉发酵产透明质酸的优化提取工艺,找到一条能提高其提取率及保持高分子量,降低蛋白质杂质含量,简单易行的提取工艺路线。并对最后纯化精品进行较为详细地理化性质检验,主要试验结果如下:1粗分离过程中发酵液透明质酸酶的去除条件,经过对酸加热方法进行研究得到在加入pH4.5为三氯乙酸的最佳温度条件选择为60℃,其分子量损失率为0.5%。2粗分离过程中蛋白质,菌体的去除条件,经过对氯仿萃取,超声波,硅藻土过滤三种方法比较研究后得出,硅藻土方法效果最好,透明质酸收率为80.11%,蛋白质去除率89.57%,残留菌体密度为0.15,分子量损失率为5.92%。3对硅藻土过滤影响条件中的等因素进行了单因子试验,选取滤饼厚度、稀释倍数、过滤温度和真空度四个最佳单因子进行L9(34)正交试验。通过极差分析得较优组合,确定其最佳工艺条件组合真空度为0.07Mpa、硅藻土敷设厚度为0.9cm、稀释倍数为1倍、温度为20℃。验证实验表明,其透明质酸收率稳定在83%。4对透明质酸粗品采用溴化十六烷基吡啶沉淀法及离子交换层析纯化法,得出蛋白质含量方面离子交换层析纯化法为0.098%,优于溴化十六烷基吡啶沉淀法0.41%。针对离子交换层析纯化影响较大的洗脱机的流速、浓度、pH等条件进行研究。得出最佳洗脱条件为浓度为0.5mol/L氯化钠溶液、pH7.0、流速1.0mL/min。5透明质酸精品理化性质检验,白色粉末带少许纤维,可溶于水,不溶于丙酮、醇、醚,分子量约1000kd;蛋白质含量为0.077%;总糖含量82.51%;葡萄糖醛酸含量40.33%;氨基葡糖含量35.47%;砷盐限度检查无明显砷斑,细菌内毒素检测小于0.5Eu/mg;紫外吸收光谱在204-206nm处有强吸收峰,在260、280nm处,基本无核酸和蛋白质的吸收峰;红外吸收光谱与透明质酸标准品一致。基本达到化妆品级透明质酸的要求,部分达到药用级的要求(分子量1000kd-4000kd,蛋白质含量<0.5%,葡糖醛酸含量42%-48%)。
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