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肌质网Ca2+-ATPase和质膜Ca2+-ATPsae是负责降低胞内Ca2+浓度的两条主要途径中非常重要的两个Ca2+转运ATP酶。本文主要围绕着结构与功能这条主线对这两个膜蛋白进行了研究,分为三个部分:
1.山莨菪对肌质网Ca2+-ATPase跨膜区的结构和功能的作用采用DSC,荧光标记和荧光测定等生物物理方法以及活性测定的生化方法研究了山莨菪对肌质网Ca2+-ATPase跨膜区和胞质区结构域的构象和酶功能的影响。DSC结果表明,山莨菪可以去稳定SRCa2+-ATPase跨膜结构域在热变性过程中被1mMCa2+引起的稳定作用。随着山莨菪的加入,原来由于Ca2+存在使跨膜结构域稳定而在热变性过程中形成的高温变性峰逐渐变小,低温峰没有明显变化,当山莨菪浓度达到10mM时,高温变性峰已基本消失,又恢复为无Ca2+时的一个变性峰曲线。色氨酸内源荧光强度的降低以及ANS外源标记荧光强度的增加进一步证明山莨菪使SRCa2+-ATPase跨膜结构域的构象变的更加松散,更多的疏水面暴露出来,因而降低了酶热变性的稳定性。构象的改变直接影响了酶的功能,活性测定实验也很好的证实了这一点,10mM终浓度的山莨菪没有显著降低酶的水解活性,却抑制了酶的Ca2+转运活性达到80%,充分表明山莨菪作用于SRCa2+-ATPase的位点位于跨膜区,导致的松散的结构不利于酶行使功能。以上这些数据同时也为山莨菪对SRCa2+-ATPase跨膜区的影响主要是通过直接的相互作用提供了有利的依据。
2.ANS结合荧光法测定ATP、Ca2+和山莨菪引起的肌质网Ca2+-ATPase的构象变化
利用探针ANS结合荧光的方法研究了底物(ATP)和配体(Ca2+和山莨菪)结合引起的肌质网(SR)Ca2+-ATPase构象的变化,特别是山莨菪和Ca2+对酶作用的相互影响,其中ANS对酶水解活性仅有较弱的反竞争性抑制作用。实验结果表明,底物和配体的结合都可以导致SRCa2+-ATPase的构象发生变化,ANS结合荧光强度的增加,但是增加的程度并不相同,依次为山莨菪>Ca2+>ATP>ADP。当ATP的浓度增大到7-15mM时,可以引起Ca2+-ATPase的ANS结合荧光强度呈“S”型增大。Ca2+对Ca2+-ATPase的作用只是增强了ANS荧光强度,而没有增加对ANS的结合数。而山莨菪引起的Ca2+-ATPase构象变化最大,不仅使ANS荧光强度增加,而且使酶结合ANS的分子数从不存在山莨菪时的8个增加到14个。Ca2+或山莨菪的结合导致酶的ANS结合荧光强度增大到最大值的一半时所对应的Ca2+或山莨菪的浓度(midconcentration)分别为1.8mM和5mM。荧光滴定实验结果表明,Ca2+结合到SRCa2+-ATPase上并没有明显影响到山莨菪对酶的结合能力以及诱导的构象变化,而山莨菪结合到SRCa2+-ATPase上却可以显著降低Ca2+对酶的结合能力,Ca2+的midconcentration也相应增加到6mM。这些结果有力地说明了高浓度的ATP能够诱导SRCa2+-ATPase形成至少另一个ATP结合位点,而山莨菪不仅可以诱导Ca2+-ATPase的构象发生变化使其疏水表面的暴露增大,还与降低了Ca2+对酶的结合能力相关。
3.位于脂伐特征结构中PMCA的活性与构象利用SM-2Bio-Beads法将从猪脑中分离纯化出来的质膜Ca2+-ATPase(PMCA)重组于相应的脂形成脂酶体。运用DPH荧光偏振和MC-540荧光标记方法,我们发现随着PC脂体系中SPM-Chol含量的增加,脂酶体的膜流动性逐渐下降,而脂分子头部基团的堆积密度逐渐升高。当体系中SPM-Chol的含量达到48mol%时,膜流动性出现大幅度下降,并且堆积密度也表现出一个大幅度的升高;说明膜的物理状态发生了明显的改变。当SPM-Chol的含量升高至72mol%以上后,变化又趋于稳定并且DPH的偏振度与Lo相膜的偏振度值相近,说明这时的膜状态已经转变为Lo相。活性测定的数据表明,在富含SPM-Chol的脂酶体中,PMCA的活性明显降低,ATP水解活性和Ca2+转运活性分别仅为SPM-Chol含量最低(14mol%)的脂样品中的50%和40%左右,钙调蛋白对PMCA水解活性的激活作用在高浓度SPM-Chol环境中也明显减弱。丙烯酰胺和HB淬灭PMCA内源色氨酸荧光实验发现SPM-Chol含量高的脂酶体中PMCA亲水区和膜区的肽段构象都变的更加紧密,而在高PC浓度的脂酶体中PMCA的结构呈现比较松散的构象。同时MIANS与PMCA结合的动态曲线也表明高浓度的SPM-Chol体系中PMCA的MIANS标记位点区域构象更加紧密而趋于包埋,因而降低了MIANS的标记速度。这些结果说明了PC这种甘油磷脂为PMCA提供了更适于发挥其功能的环境,包括流动性大和松散的脂双层结构,而SPM-Chol的环境使PMCA处于抑制状态,特别是与高浓度下形成了raft结构即处于Lo相状态相关。