应激是机体对机体外界或机体内部各种刺激产生的非特异性应答反应的总和。适度应激可提高机体的反应能力和维持内环境的稳态;过度应激则会对人体产生危害,导致机体神经内分泌和心理的变化。随着现代社会生活节奏的加快,工作和生活负担的加重,人们面临的工作压力及心理压力越来越大。越来越多的证据表明,慢性应激是人类多种重大疾病的重要病因和诱因,能引发多种重大疾病,如肿瘤、心血管疾病、焦虑症、抑郁症、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)等躯体和精神疾病。军人作为一个特殊群体,面临着复杂而强烈的军事应激因素,如生存环境恶劣、精神高度紧张及军事作业任务繁重等。强烈的军事应激因素不仅会对军人健康造成直接危害,还将产生严重的体力、脑力和心理损害,是造成军事作业能力降低和非战斗性减员的重要因素。因此,军事应激损伤防护措施的研究是近年来各国军队的研究重点。目前对于军事应激主要以心理干预和补充氨基酸和维生素对应激损伤进行防治,但起效时间较慢,效果有限。已有研究表明,无论何种原因引起的应激,其病理生理学变化均是神经内分泌免疫调节(Neuroendocrine-immune network,NIM)网络的平衡失调。现代应激理论认为,NIM网络是维持机体内环境及生理功能平衡和稳定的基础,该观点与中医学中的“阴阳气血、脏腑机能”平衡的整体观是高度一致的。因此依据中医整体观、辨证观、平衡观以及现代应激理论,探讨采用中医药手段干预应激的方法和途径、从中药中寻找或创制防治应激损害的药物是一个具有良好前景的研究方向。六味地黄苷糖(LW-AFC)是首个来源于六味地黄汤,由多糖、寡糖和糖苷三个活性成分群组成的中药5类新药。前期研究结果表明,LW-AFC对多种原因所致NIM紊乱具有明显调节作用,同时具有改善急性应激所致的认知功能损伤和AD模型小鼠学习记忆能力的作用。但是对于LW-AFC能否改善慢性应激所致的情绪和认知损伤,尚不明确。因此,本课题根据军事应激源的多样性和应激反应的复杂性,针对军事应激最常遇到的问题:饮水缺乏、睡眠剥夺、狭小战斗空间和对未来不可预计的紧张心理,首先建立单因素应激(空瓶刺激模型、睡眠剥夺应激动物模型、束缚应激动物模型)和慢性多重应激动物模型模拟这几种应激状态,并观察不同军事应激模式和不同军事应激负荷对情绪和认知功能的影响及特点,继而研究LW-AFC对慢性应激所致焦虑、抑郁样行为及学习记忆能力损伤的作用,最后探讨LW-AFC改善慢性应激致情绪和认知损伤的作用机制。第一章LW-AFC对单因素应激小鼠情绪的影响采用不确定性空瓶饮水刺激法、睡眠剥夺应激法和束缚应激法分别模拟军事应激中饮水缺乏、睡眠缺失及狭小空间的常见现象,观察单因素应激对小鼠情绪的影响及LW-AFC的改善作用。1.空瓶刺激法对小鼠焦虑样行为的影响采用每天给予小鼠一次空瓶刺激,10 min/次,连续14 d,建立不确定性空瓶饮水刺激模型。结果表明,与空白对照组相比,空瓶刺激组和生理应激组小鼠体重在空瓶刺激7 d和14 d后均显著下降;旷场实验结果显示,空瓶刺激小鼠自主活动显著升高,在中央区停留时间有下降的趋势;高架十字迷宫实验结果显示,定时饮水组小鼠在开放臂内停留时间显著减少,进入开放臂的次数有下降趋势。与定时饮水组相比,空瓶刺激组和生理应激组小鼠体重在空瓶刺激7 d后显著下降;旷场实验结果显示,空瓶刺激小鼠自主活动无明显变化,在中央区停留时间有下降的趋势;高架十字迷宫实验结果显示,空瓶刺激小鼠进入开放臂的次数和在开放臂内停留时间均无明显变化。上述结果提示,空瓶刺激14 d小鼠未出现焦虑情绪;单纯性缺水和单笼饲养可对小鼠行为产生较大影响。2.LW-AFC对睡眠剥夺小鼠焦虑样行为的影响采用改良平台法对小鼠连续睡眠剥夺96h,建立睡眠剥夺模型。结果表明,与正常对照组相比,大平台对照组小鼠体重显著下降,提示实验未排除水环境对小鼠体重产生的影响;与大平台对照组相比,睡眠剥夺组小鼠体重显著下降,LW-AFC对小鼠体重无明显改善作用。旷场实验结果表明,与正常对照组相比,大平台对照组小鼠在旷场中运动总距离显著增加,在旷场中央区停留时间无明显变化;与大平台对照组相比,睡眠剥夺小鼠在旷场中运动总距离显著降低,在旷场中央区停留时间显著降低;高架十字迷宫实验结果表明,与正常对照组相比,大平台对照组小鼠在开放臂中停留时间和进入开放臂的次数均无明显变化;与大平台对照组相比,睡眠剥夺小鼠在开放臂中停留时间和进入开放臂的次数均显著降低;LW-AFC具有增加小鼠自主活动、在旷场中央区停留时间和进入开放臂次数的趋势。上述结果提示,睡眠剥夺小鼠表现出明显的焦虑样行为,LW-AFC对睡眠剥夺小鼠焦虑样行为具有改善的趋势。3.LW-AFC对束缚应激小鼠焦虑样行为的影响采用每天束缚小鼠2 h,连续14 d,建立束缚应激模型。结果表明,与正常对照组相比,束缚应激7 d和14 d后小鼠体重均有降低的趋势,LW、LW-AFC对小鼠的体重无明显改善作用。旷场实验结果显示,束缚应激7d小鼠自主活动无明显变化,在旷场中央区停留时间有下降的趋势;高架十字迷宫实验结果显示,进入开放臂的次数和在开放臂内停留时间均显著减少;LW及LW-AFC具有增加小鼠在旷场中央区停留时间、进入高架十字迷宫开放臂的次数和在开放臂内停留时间的趋势。束缚应激14 d小鼠自主活动有增加的趋势,在旷场中央区停留时间无明显变化;进入开放臂的次数和在开放臂内停留时间均无明显变化。上述结果提示,束缚应激7 d可诱发小鼠产生焦虑样行为,而束缚应激14 d小鼠焦虑情绪消失,LW及LW-AFC具有改善束缚应激7 d小鼠焦虑样行为的趋势。第二章LW-AFC对慢性多重应激模型小鼠情绪和认知损伤的影响采用1 4种应激条件随机组合,建立慢性不可预知性温和应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)模型,用于模拟军事应激中多种复杂未知因素的刺激。选择氟西汀(Fluoxetine,FLU)作为阳性药,观察CUMS 14 d和CUMS 28 d对小鼠的情绪和学习记忆功能的改变,评价LW-AFC低剂量(0.8g/kg)、中剂量(1.6g/kg)和高剂量(3.2g/kg)对其的改善作用,从时效和量效两个方面考察LW-AFC的药效。于造模结束后进行行为学实验,评价LW-AFC对CUMS模型小鼠焦虑、抑郁样行为及学习记忆能力损伤的影响。1.LW-AFC对CUMS模型小鼠体重变化的影响与正常组小鼠相比,应激7、14、21、28 d小鼠体重均显著降低,FLU、LW及LW-AFC对小鼠体重无明显改善作用。2.LW-AFC对CUMS模型小鼠焦虑样行为的影响采用旷场和高架十字迷宫实验检测小鼠焦虑样行为。CUMS 14 d后,旷场实验结果显示,与正常组小鼠相比,模型组小鼠在旷场中运动总距离显著升高,在旷场中央区停留时间显著降低;高架十字迷宫实验结果显示,模型组小鼠进入开放臂的次数和在开放臂内停留时间均显著降低。给予FLU后可显著增加模型小鼠进入开放臂的次数,给予LW可增加模型小鼠在旷场中央区停留时间、进入开放臂的次数和在开放臂内停留时间的趋势,给予LW-AFC(3.2g/kg)能够显著增加小鼠在开放臂内停留时间和进入开放臂的次数。CUMS 28 d后,模型组小鼠在旷场中运动总距离显著升高,在旷场中央区停留时间显著降低,进入高架十字迷宫开放臂次数和停留时间均显著降低。LW-AFC(1.6g/kg)可显著增加小鼠在开放臂停留时间,FLU和LW具有增加小鼠在旷场中央区停留时间、进入开放臂的次数和在开放臂内停留时间的趋势。上述结果提示,CUMS 14 d和28 d均可诱发小鼠产生明显的焦虑样行为,FLU、LW和LW-AFC可以改善CUMS 14 d小鼠焦虑样行为,LW-AFC对CUMS 14 d和28 d小鼠焦虑样行为均具有改善作用。3.LW-AFC对CUMS模型小鼠抑郁样行为的影响采用糖水偏爱实验检测小鼠抑郁样行为。结果表明,与正常组小鼠相比,CUMS 14 d后,各组小鼠糖水消耗率无明显变化,提示CUMS 14 d未诱发小鼠产生抑郁样行为。CUMS 28 d后,模型组小鼠糖水消耗率显著降低,FLU、LW-AFC(3.2g/kg)能显著增加小鼠糖水消耗率。上述结果提示CUMS 28 d可诱发小鼠产生明显的抑郁样行为,FLU、LW-AFC均具有改善小鼠抑郁样行为的作用,且与阳性药FLU的作用相当,LW具有改善小鼠抑郁样行为的趋势。4.LW-AFC对CUMS模型小鼠物体识别记忆的影响采用新物体识别实验检测小鼠物体识别记忆能力。结果表明,CUMS 14 d后,模型组小鼠于训练期后1 h对新物体的识别指数无明显变化,于训练期后24 h对新物体的识别指数有降低的趋势,提示CUMS 14 d对小鼠短时记忆无影响,对小鼠长时记忆有损害的趋势,FLU、LW及LW-AFC均有改善小鼠长时记忆的趋势。CUMS 28 d后,模型组小鼠于训练期后1 h对新物体的识别指数无明显变化,于训练期后24 h对新物体的识别指数有降低的趋势,提示CUMS 28 d对小鼠短时记忆无影响,对CUMS组小鼠长时记忆有损害的趋势,LW及LW-AFC均有改善小鼠长时记忆的趋势,而FLU具有损伤小鼠长时记忆的趋势。5.LW-AFC对CUMS模型小鼠空间学习记忆的影响采用水迷宫实验检测小鼠空间学习记忆能力。结果表明,与正常组小鼠相比,CUMS 28 d后,模型组小鼠学习期逃避潜伏期有延长的趋势,LW-AFC(3.2g/kg)具有缩短小鼠逃避潜伏期的趋势;模型组小鼠测试期逃避潜伏期显著增加,LW-AFC(3.2g/kg)可显著降低小鼠逃避潜伏期;模型组小鼠穿环次数有降低的趋势,FLU、LW及LW-AFC均有增加小鼠穿环次数的趋势;模型组小鼠在目标象限停留时间显著降低,FLU、LW-AFC(0.8、3.2g/kg)可显著增加小鼠在目标象限停留时间。上述结果提示,CUMS 28 d会损伤小鼠的空间学习记忆能力;FLU、LW-AFC具有改善CUMS模型小鼠空间学习记忆损伤的作用,LW对小鼠空间学习记忆具有改善的趋势。第三章LW-AFC改善慢性应激致小鼠情绪和认知损伤作用机制的初步研究LW-AFC能够改善慢性多重应激小鼠焦虑、抑郁样行为及学习记忆能力损伤,在此基础上,本研究从HPA轴功能、神经递质及NMDAR-BDNF信号通路等方面探讨了LW-AFC发挥抗应激药效的可能作用机制。1.LW-AFC对CUMS模型小鼠HPA轴功能的影响采用放射性免疫法和酶联免疫法检测小鼠血浆CORT、ACTH、下丘脑CRH含量。结果表明,与正常组小鼠相比,CUMS 14 d小鼠血浆中CORT含量显著升高,血浆中ACTH含量显著降低,下丘脑释放的CRH含量显著降低,FLU、LW及LW-AFC可显著降低血浆中CORT含量,LW及LW-AFC(1.6g/kg)可显著升高血浆中ACTH含量,LW-AFC(3.2g/kg)可显著升高下丘脑释放的CRH含量。CUMS 28 d模型小鼠血浆中CORT含量显著升高,血浆中ACTH含量显著升高,下丘脑释放的CRH含量显著升高,FLU及LW可显著降低小鼠血浆中CORT含量,LW及LW-AFC可显著降低小鼠血浆中ACTH含量。上述结果提示,CUMS会导致小鼠HPA轴功能异常,FLU、LW及LW-AFC对CUMS小鼠HPA轴功能紊乱具有调节作用。2.LW-AFC对CUMS模型小鼠海马组织中单胺类神经递质的影响采用高效液相色谱法检测小鼠海马组织中单胺类神经递质的含量。结果表明,与正常组小鼠相比,CUMS 14 d模型组小鼠海马中5-HT、5-HIAA、DOPAC、HVA含量显著降低,DA含量有降低的趋势,FLU具有增加小鼠海马中DA、DOPAC、HVA含量的趋势,LW可显著增加小鼠海马中5-HIAA、DOPAC的含量,LW-AFC可显著增加小鼠海马中5-HT、5-HIAA、NE、DA、DOPAC、HVA的含量。CUMS 28 d模型组小鼠海马中DA含量显著降低,5-HT、5-HIAA、HVA的含量有降低的趋势,NE、DOPAC的含量无明显变化,LW及LW-AFC有增加小鼠海马中5-HT、5-HIAA含量的趋势,FLU及LW-AFC(0.8g/kg)可显著增加小鼠海马中DA含量。上述结果提示,CUMS会导致小鼠脑内单胺类神经递质含量减少,LW-AFC对CUMS 14 d模型小鼠主要是通过5-HT与DA系统的协同作用调节单胺类神经递质的含量,LW-AFC对CUMS 28 d模型小鼠主要是通过DA系统调节单胺类神经递质的含量。3.LW-AFC对CUMS模型小鼠海马组织中NMDAR-BDNF信号通路的影响采用Western Blot法检测小鼠海马组织NMDAR-BDNF信号通路中相关蛋白表达水平。结果表明,与正常组小鼠相比,CUMS 14 d模型小鼠海马中NR2B、BDNF蛋白表达水平显著增加,NR2A、NRSF蛋白表达水平无明显变化,GR蛋白表达有降低的趋势,FLU和LW具有降低小鼠海马中NR2B、BDNF蛋白表达的趋势,LW-AFC(3.2g/kg)可显著降低NR2B蛋白表达水平。CUMS 28 d模型小鼠海马中NR2A蛋白表达水平显著升高,NR2B蛋白表达具有升高的趋势,BDNF蛋白表达水平显著降低,NRSF蛋白表达有增加的趋势,GR蛋白表达无明显变化,FLU、LW及LW-AFC均具有降低NR2A蛋白表达的趋势,LW可显著增加BDNF蛋白表达水平,LW-AFC(0.8g/kg、1.6g/kg)可显著降低NRSF蛋白表达水平。上述结果提示,CUMS会导致小鼠脑内NR2A、NR2B和BDNF蛋户白表达水平发生改变,CUMS 14 d模型小鼠主要表现在NR2B蛋白表达水平的变化,CUMS 28 d模型小鼠主要表现在NR2A蛋白表达水平的变化,LW-AFC可能通过NMDAR-BDNF信号通路发挥抗慢性应激作用。通过以上研究,主要得到以下结论:(1)LW-AFC具有改善束缚应激和睡眠剥夺应激小鼠焦虑样行为的趋势及CUMS模型小鼠焦虑、抑郁情绪及学习记忆能力损伤的作用。(2)LW-AFC可能通过调节CUMS小鼠HPA轴功能紊乱、单胺类神经递质的含量及NMDAR-BDNF信号通路而发挥抗慢性应激的作用。(3)本研究提示LW-AFC有望能成为慢性应激致情绪和认知损伤潜在的预防和治疗药物。