论文部分内容阅读
目的:确立壁虎神经细胞的体外培养条件;建立壁虎脊髓细胞分离培养方法;建立壁虎胎脑皮层胶质细胞和神经元的分离培养纯化方法;建立壁虎胎脑皮层细胞永生化细胞系;为了解壁虎神经系统细胞组成和生物学功能以及相关基因的细胞学功能提供细胞研究平台。方法:(1)采用植块法原代培养多疣壁虎(Gekko japonicus, Gecko)胎脑皮层、脊髓组织细胞,尝试不同渗透压、pH值、温度、CO2浓度等培养条件进行培养,观察细胞生长状态、贴壁能力,以确定细胞培养条件。(2)酶消化法分离、培养、纯化成年壁虎脊髓细胞,免疫细胞化学方法对获得的不同形态的细胞进行鉴定。(3)采用差速贴壁及反复传代相结合方法培养、纯化壁虎胎脑皮层胶质细胞,采用B27和Neurobasal无血清培养基培养、纯化壁虎胎脑皮层神经元,对纯化的细胞进行免疫细胞化学方法鉴定。(4)采用脂质体转染SV40 T抗原基因方法建立壁虎胎脑皮层神经细胞永生化细胞系,采用RT-PCR、基因组DNA-PCR、点杂交和Southern blot检测克隆化细胞中SV40 T基因的表达和整合;光学显微镜和透射电子显微镜观察细胞的显微和超微结构;定期冻存和复苏观察细胞存活率;通过MTT、流式细胞仪、BrdU掺入方法检测细胞生长曲线、细胞周期和细胞增殖;通过染色体核型分析、细胞平板克隆、软琼脂克隆形成率、血清依赖、生长接触抑制实验检测细胞的转化特征;免疫组织化学对克隆化细胞系进行标志抗体鉴定。结果:(1) 30℃、5%CO2、饱和湿度培养条件,含有10%FBS的DMEM/F12(1:1)培养基,渗透压200~260 mmol/kg,pH 7.2是壁虎神经细胞的最佳培养条件。(2)成体壁虎脊髓组织在细胞培养过程中获得八种形态的细胞,其中神经元样多极细胞为NF阳性,神经胶质细胞样纤维形细胞GFAP阳性。(3)原代培养的壁虎胎脑皮层胶质细胞GFAP阳性表达,四代后纯度达95%以上;采用Neurobasal培养基,壁虎胎脑皮层神经元生长良好,NF和MAPⅡ表达阳性,至第10天阳性表达细胞纯度达95%以上。(4)采用脂质体将SV40 T基因转入体外培养的壁虎胎脑皮层细胞,经G418筛选,共获得49个阳性克隆。其中两个克隆,转化细胞1 (Gsn1)和转化细胞3 (Gsn3)已经连续传代培养50代,RT-PCR、DNA-PCR、点杂交和Southern blot检测到克隆化细胞中SV40 T基因的表达和基因组整合。形态学观察表明克隆化细胞具有原代培养细胞的多数典型特征,克隆化细胞均不能在软琼脂中生长;核型分析、克隆形成率、血清依赖、生长接触抑制实验表明克隆化细胞具备了部分转化特征:染色体核型分析表明两株克隆化细胞(Gsn1和Gsn3)的核型有非整倍体、多倍体出现;生长和增殖实验发现两株克隆化细胞(Gsn1和Gsn3)的生长速度明显快于未转化细胞;克隆形成率上升;血清依赖降低;生长接触抑制性消失;免疫细胞化学结果显示Gsn1为GFAP阳性细胞,Gsn3为GC阳性细胞。结论:本研究确立了壁虎神经细胞的培养条件,适用于壁虎神经细胞的体外培养;建立了成年壁虎脊髓细胞培养方法,获得8种不同形态的细胞,包括GFAP阳性的胶质细胞样和NF/MAPII阳性的神经元样细胞;建立了原代培养壁虎胎脑皮层神经胶质细胞和神经元的分离培养方法,纯度均可达95%以上;建立了壁虎胎脑皮层细胞永生化细胞系,其中克隆化细胞Gsn1和Gsn3既具有与原代细胞类似的形态特征又具备了部分转化细胞的特性。经免疫组化鉴定Gsn1为GFAP阳性细胞,Gsn3为GC阳性细胞。本研究为了解壁虎神经系统细胞组成和相关基因的细胞学功能提供了细胞研究平台。