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邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是热塑性塑料生产中常用的一类增塑剂,是重点监测的环境污染物之一。PAEs容易从塑料母体中释放出来,进入环境,并进入人类食物链;也容易从包装材料和加工设备中向食品中迁移。PAEs在人体内发挥着类似雌性激素的作用,对食品的污染已成为国际关注的焦点,其中多达17种是我国卫生部公布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第六批)》的违禁物。本文旨在建立检测食品样品中邻苯二甲酸酯类增塑剂的免疫分析方法。 本研究采用化学合成手段和免疫学的基本理论,针对PAEs所特有的共同结构,设计出PAEs的半抗原,再与载体蛋白通过戊二醛法偶联,得到相应的全抗原,进行动物免疫获得多克隆抗体,建立间接竞争ELISA法,并对ELISA方法进行多方面优化,从而建立了3种快速灵敏检测PAEs的间接竞争ELISA方法,并用于实际样品检测。本研究取得主要结果如下: (1)筛选出与抗PAEs抗体相对应的3个半抗原,其中1个是邻苯二甲酸的半抗原(4-氨基邻苯二甲酸,4-APA),2个是邻苯二甲酸二甲酯的半抗原(4-氨基邻苯二甲酸二甲酯,4-DMAP;4-(2-氨基乙酰胺)邻苯二甲酸二甲酯,4-DMAAP)。通过戊二醛法偶联载体蛋白BSA和OVA分别得到免疫原和包被原,经免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。 (2)以4-APA-BSA作为免疫原获得了优质抗体T1,对ELISA方法的条件进行多方面优化后,构建了检测邻苯二甲酸的ELISA方法,其半抑制浓度IC50值为167.7 ng/mL;检测范围为20.7-892.6 ng/mL(IC20-IC80),检测限LOD为4.8 ng/mL(IC10)。该方法特异性好,与邻苯二甲酸类似物的交叉反应率均小于0.4%。该方法进行食用油样品分析的添加回收率在77.9%-88.3%之间,变异系数为8.4%-14.6%。 (3)以4-DMAP-BSA作为免疫原获得了优质抗体T3,对ELISA方法的条件进行多方面优化后,构建了检测邻苯二甲酸二甲酯的ELISA方法,其IC50值为150.9 ng/mL;检测范围为17.6-967.0 ng/mL(IC20-IC80),检测限LOD为4.89 ng/mL。该方法特异性好,与邻苯二甲酸二甲酯类似物的交叉反应率(除邻苯二甲酸二乙酯为1.2%)均小于0.1%。该方法进行食用油样品分析的添加回收率在91.5%-105.6%之间,变异系数为9.4%-15.1%。 (4)以4-DMAAP-BSA作为免疫原获得了优质抗体T6,对ELISA方法的条件进行多方面优化后,构建了检测邻苯二甲酸二甲酯的ELISA方法,其IC50值为312.6ng/mL;检测范围为14.8-2422.3 ng/mL(IC20-IC80),检测限LOD=1.1 ng/mL。该方法特异性好,与邻苯二甲酸二甲酯类似物的交叉反应率(除邻苯二甲酸二乙酯为12.0%)均小于0.6%。该方法进行食用油样品分析的添加回收率在87.2%-123.8%之间,变异系数为7.5%-9.4%。 结果发现:4-APA-BSA免疫产生的抗体可检测各种邻苯二甲酸酯水解后的共同产物邻苯二甲酸,而4-DMAP-BSA和4-DMAAP-BSA免疫产生的抗体,不能够检测不同长度酯链的邻苯二甲酸酯,只对邻苯二甲酸二甲酯有特异性。