肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝脏原发性肿瘤,位居肿瘤相关致死性病因第三位。放射治疗(Radiation therapy,RT)是恶性肿瘤的重要治疗手段之一,其机理是通过电离辐射引起细胞内DNA等生物活性分子损伤。但由于HCC恶性程度高,放疗耐受性差,其放射治疗临床获益较低,目前患者的预后仍较差。因此,寻求一种增加肿瘤放射敏感性的同时,对人体正常组织副作用较小的放射增敏剂,具有重要的临床意义。脂肪组织源性间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell,AD-MSC)是一种易获取且数量丰富的干细胞,已有多项研究发现其在调节细胞信号转导、影响细胞周期进程、诱导凋亡和抑制肿瘤细胞中具有重要作用。本研究的目的是探讨AD-MSC对HCC细胞的放疗增敏作用并探究其内在机制。本研究包含体外和体内两部分实验,观察AD-MSC联合RT对人HCC细胞株体外模型以及裸鼠肝癌移植瘤模型的抑制效应,并在全文第三部分探讨两者联合治疗的内在作用机制。第一部分脂肪源性间充质干细胞在肝癌细胞株放射治疗中的作用研究目的探索RT与AD-MSC联合治疗的体外实验模型,明确RT治疗联合干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)治疗后,HCC细胞株在细胞增殖、克隆形成、侵袭迁移及肿瘤干性方面的改变。探讨干细胞治疗在HCC细胞中是否具有放疗增敏作用及寻求最佳联合治疗模式。研究方法收集浙江大学医学院附属第一医院整形外科健康患者的抽脂术抽吸物,分离脂肪组织,提取并培养AD-MSC。通过流式细胞术鉴定干细胞表面特异性标志物CD44、CD73、CD90及CD105,通过体外诱导培养并鉴定其具有成脂及成骨细胞分化能力。将HCC细胞株及正常肝细胞株分成4组,即空白对照组、放射治疗组、干细胞治疗组及联合治疗组。给予各组细胞不同照射剂量、不同照射时间后联用干细胞治疗,通过CCK-8法检测细胞增殖情况;平板克隆形成试验检测细胞株克隆形成能力;成球实验检测各组肿瘤细胞干性改变;划痕试验检测细胞运动修复能力;Transwell试验检测细胞迁移侵袭能力;通过流式细胞术检测细胞株肿瘤干性标志物表达情况。结果将正常肝细胞系LO2作为对照,CCK-8实验结果显示联合治疗组HCC细胞株Huh7、Hep G2细胞增殖显著抑制。同时对比空白对照组、RT和MSC单一治疗组,联合治疗更显著抑制细胞克隆形成能力、侧向运动能力、迁移侵袭能力,以及更显著降低肿瘤干性。结论体外细胞实验表明对于不同种类HCC细胞株,MSC可以增加RT对HCC的生长抑制作用,同时联合治疗结果表明其与照射剂量和时间密切相关。对比于单一治疗具有更显著的肿瘤抑制效应。第二部分脂肪源性间充质干细胞增强肝癌放疗敏感性的动物实验研究研究目的多项临床前研究表明MSC治疗具有抗肿瘤作用。第一章节MSC与RT联合的体外研究显示,MSC可能具有放射增敏作用,并且治疗效果与时间及照射剂量密切相关。本章节通过动物体内实验进一步明确MSC与RT联合治疗对HCC的抑制作用。研究方法根据第一部分的研究结论,建立人肝癌细胞株源性-裸鼠肝癌移植瘤模型。购买性状基本一致的Balb/c品系雌性裸鼠,于右侧腋下皮肤注射同等量Huh7细胞,每3天观察成瘤情况。在肿瘤体积约200mm~3左右记为day 0,随机将裸鼠分成4组:空白对照组于尾静脉注射100ul生理盐水;放射治疗组使用Varian Trilogy直线加速器接受RT治疗,并于尾静脉注射100ul生理盐水;干细胞治疗组于尾静脉注射100ul含有10~6个AD-MSC的生理盐水;联合治疗组接受等剂量RT照射后同样进行尾静脉注射含有等量AD-MSC的生理盐水。观察并记录肿瘤生长情况及裸鼠一般情况,绘制时间-肿瘤生长曲线。在实验结束时处死裸鼠,留取肿瘤样本进行后续免疫组化、PCR等实验,评估肿瘤增殖及凋亡情况。结果在成功构建裸鼠HCC移植瘤模型的基础上,分别对4组裸鼠进行相应处理。实验发现AD-MSC与RT联合治疗组显著延迟肿瘤生长时间,通过免疫组化实验发现联合治疗组肿瘤增殖系数Ki-67明显下降,TUNEL染色表明细胞凋亡数量显著上升。结论AD-MSC与RT联合在裸鼠肝癌移植瘤模型中可产生显著的放疗增敏效应,AD-MSC在协同RT抑制肿瘤增殖、促进凋亡中可能具有潜在治疗作用,但其内在机制有待进一步探索。第三部分脂肪源性间充质干细胞对肝癌放疗增敏的机制探讨研究目的根据前两部分的研究结论,将各组裸鼠肿瘤组织样本进行高通量转录组测序分析,并通过慢病毒载体质粒转染、细胞表型功能实验、Western blot、RT-PCR等验证测序结果,探讨MSC治疗实现HCC放疗增敏的内在作用机制。研究方法通过高通量转录组测序差异分析显示对比其他组数据,联合治疗组有76种基因具有异常表达。结合热图、韦恩图、Reactome FI基因互作网络分析以及查阅文献,我们认为干扰素诱导跨膜蛋白1(Interferon-induced transmembrane protein1,IFITM1)可能是主要的作用位点。通过慢病毒载体质粒转染我们分别获得IFITM1基因敲低组细胞sh IF Huh7、过表达组细胞IF-OE Huh7以及转染对照组细胞IF-NC Huh7。通过克隆形成试验、成球实验等细胞功能分别检测IFITM1过表达、敲低组细胞分组处理后各项肿瘤性能的变化。通过Western Blot、RT-PCR检测IFITM1过表达及敲低组细胞分组处理后STAT-3、P53、MMP家族、Caspase家族等表达改变。结果我们发现IFITM1敲低组sh IF Huh7细胞株增殖抑制;sh IF Huh7细胞经AD-MSC与RT联合治疗后,相较于IF-NC Huh7细胞及其他治疗组,在细胞增殖能力及肿瘤干性显著降低,而IF-OE Huh7细胞联合治疗组肿瘤抑制作用显著缓解。与RT-PCR检测的m RNA水平改变相同,Western Blot检测发现sh IF Huh7细胞经联合治疗后相较于IF-NC Huh7细胞STAT3、MMP2及MMP9表达抑制,Caspase家族、P21及P53表达增加;而IF-OE Huh7细胞经联合治疗后相较于IF-NC细胞STAT3、MMP2及MMP9表达增加,Caspase家族、P21及P53表达显著抑制。结论通过人工构建过表达与敲低细胞株,将所筛选的差异基因进行定性定量验证。结果表明,IFITM1在AD-MSC与RT联合治疗的作用效果可能归因于STAT3、P21、P53、MMP家族及Caspase家族的改变。