小麦白粉病是世界性病害,给小麦的产量和品质造成了很大危害。提高小麦对白粉病的抗性是国内外科研工作者和农业育种专家长期关注的热点。前人研究表明小麦的近缘物种簇毛麦(Haynaldiavillosa)对小麦白粉病具有广谱抗性,其抗病性由位于6V染色体短臂上的基因Pm21控制。由于6VS染色体臂与小麦染色体不交换,难以对Pm21基因进行精细定位和遗传作图,目前还不清楚Pm21是由一个基因在起抗病作用,还是一个由多个基因组成的基因簇在协同起抗病作用,所以Pm21被认为是6VS上的一个基因座(Locus)。南京农业大学细胞遗传研究所将细胞遗传学和分子遗传学相结合,克隆出簇毛麦染色体6V短臂上位于Pm21基因座的抗病基因S/tpk-V。近几年,本实验室利用花粉和雌配子辐射,结合杂交和回交,创造了一系列涉及6VS短臂不同区域的易位系和缺失系,白粉病抗性鉴定表明这些特殊的细胞学材料表现出了不同的抗、感病表型。这些细胞学材料为我们进一步定位Pm21基因座和克隆该基因座的其它基因提供了非常有价值的材料。本研究综合分析前人对涉及6V染色体短臂不同区域的易位系和缺失系的抗性鉴定、外缘染色体原位杂交和分子标记结果,进一步缩小了抗病基因座所在的分子标记覆盖区域。利用比较基因组学方法研究,发现该区域与水稻第二条染色体存在较好的共线性,而水稻在该共线性区段有成串的LRR基因序列。簇毛麦Pm21基因座中有没有这个LRR基因簇?如果簇毛麦中存在这样一个LRR基因簇,该基因簇与白粉病抗性之间有没有关系?如果该LRR基因簇与白粉病抗性之间存在一定的关系,那么基因簇中哪个基因在起作用?针对上述研究结果及假设,本研究开展了以下三个方面的研究:1、基于比较基因组学方法,研究Pm21基因座是否存在LRR基因簇。根据水稻第二条染色体上的LRR基因序列设计引物,以中国春、92R137、簇毛麦、硬簇麦和一系列细胞学材料的DNA为模板进行PCR扩增,结果表明有多对引物都在6VS上扩增出了多态性条带,并且这些条带位于Pm21基因座。该研究结果表明:在簇毛麦Pm21基因座确实存在LRR基因簇。2、利用病毒介导基因沉默的方法沉默Pm21基因座的LRR基因簇,研究该基因簇与白粉病抗性之间的关系。与水稻相比,大麦与簇毛麦具有更近的亲缘关系。为了能成功获得簇毛麦该LRR基因簇的基因片段,本研究根据大麦6HS上的LRR基因序列设计PCR引物,在簇毛麦中扩增获得Pm21基因座的LRR基因片段,进一步利用VIGS方法在含有6VS染色体短臂的南农9918中沉默LRR基因片段,研究其抗病性是否受到抑制。Q-PCR结果显示与接种了 γ空载对照的植株相比,涂抹重组病毒的植株中目的LRR插入片段的表达水平均有不同程度的下降,表明这些LRR基因已经被沉默。对基因沉默的植株叶片接种混合白粉菌小种,待感病对照充分发病后于显微镜下统计菌丝发育情况,发现其中两个片段HvLLRR-12、HvLRR-13沉默植株叶片上白粉菌发育成次级菌丝数较γ空载对照明显增多,尤其是片段HvLRR-12沉默植株叶片上的次级菌丝布满整个视野,甚至有多处生长出分生孢子梗。上述结果表明:Pm21基因座的LRR基因簇与小麦白粉抗性有一定关系。3、利用同源克隆法克隆Pm21基因座的LRR基因,并利用南农9918的感病突变体寻找LRR可能的突变位点。本实验室已获得抗白粉病品种小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系南农9918的感病突变体NM14,本研究进一步检测是否由于上述LRR基因簇的基因发生突变引起了南农9918的抗病表型改变。根据大麦6HS上的LRR基因设计引物,在南农9918的野生型及突变体中同时进行同源克隆,通过对野生型和突变体的测序序列进行比对,寻找可能的突变位点。序列比对结果显示:由引物AK362389-PD2-44-1136扩增出的片段在第328bp、581bp、959bp处可能存在9918和NM14的差异,在其他地方完全一致;引物AK354248-PD1-4/1975扩增出的片段在第524bp、1293bp处可能存在9918和NM14的差异,在其他地方完全一致。但由于受到测序条数和簇毛麦参考序列的限制,我们不能说这些位点就是造成9918抗病性下降的突变位点,还需要更多序列和不同杂交群体的验证。