细胞死亡是一种基本生物过程,对维持组织机能和形态具有重要作用。细胞死亡的执行需要一些重要程序的相互配合,包括:凋亡、自噬、坏死和有丝分裂灾难等。细胞凋亡,指直接导致细胞死亡的特征性改变。在过去的几十年里,细胞凋亡被广泛研究,针对细胞凋亡的放射治疗策略成为肿瘤治疗的重要手段之一。自噬是一种溶酶体依赖的自我吞噬过程,可维持细胞稳态并为底物提供能量。自噬在营养缺乏、ROS、乏氧、DNA损伤等应激条件下能够促进细胞存活。然而,当细胞损伤超出一定生理条件下修复的限度时,自噬就引起程序性细胞死亡,即自噬性死亡。除凋亡和自噬以外,有丝分裂灾难可作为一种非典型的细胞死亡方式防止DNA损伤应答中有丝分裂的干扰和基因组不稳定性,从而发挥抑制肿瘤的作用。当细胞进入有丝分裂期,经过短暂的细胞周期停滞后细胞并未分离,可导致有丝分裂灾难的发生。脱氧胞苷激酶(Deoxycytidine kinase,d CK)是脱氧核苷酸生物合成补救途径中的关键酶,能够维持正常DNA代谢并磷酸化多种抗病毒和抗癌的核苷类似物药物,这些药物只有在磷酸化后才能被活化,从而抑制肿瘤生长。我们前期研究发现,d CK能够使内源性脱氧核苷酸磷酸化,并参与DNA损伤修复过程。d CK蛋白有四个磷酸化位点:Thr-3,Ser-11,Ser-15和Ser-74。Ser-74位点磷酸化可激活d CK,而Thr-3对促进d CK的稳定性具有重要作用。在电离辐射(IR)作用下,共济失调毛细血管扩张突变蛋白(The protein kinase ataxia-telangiectasia mutated,ATM)能够磷酸化d CK Ser-74位点并激活d CK,促进d CK与周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin-dependent kinases,Cdk1)相互作用来调节G2/M期检查点。此外,ATM能够抑制Akt/m TOR/P70S6K通路促进IR诱导的自噬,但迄今为止,IR作用下d CK与细胞死亡的关系及其作用机制尚未见报道。目的:本文旨在研究d CK在IR诱导细胞死亡的过程中的作用及其可能作用机制,为肿瘤的基因靶向治疗提供新依据。方法:(1)选用人宫颈癌细胞株He La,人乳腺癌细胞株SKBR3和MDA-MB-231为研究对象;(2)通过基因工程技术构建d CK沉默及d CK过表达细胞模型;(3)通过3-MA,Rapamycin,ZVAD-FMK,Necrostatin-1,Ferrostatin-1区分不同类型的细胞死亡;(4)CCK-8和集落形成检测细胞存活和辐射敏感性;(5)Western blot检测蛋白水平;(6)免疫共沉淀技术(Co-immunoprecipitation)检测蛋白与蛋白之间的结合情况;(7)流式细胞术检测细胞总死亡率、凋亡、自噬、细胞周期、多倍体及有丝分裂细胞;(8)深部X射线治疗机照射细胞,照射条件:电流18.0m A,电压180k V,滤板0.25mm Cu和1.0mm Al,剂量率0.40 Gy·min-1,靶皮距60cm。结果:1.沉默d CK增加IR诱导的细胞死亡沉默d CK的He La细胞分别给予不同剂量IR处理,集落形成结果显示,与空载体(p SUPER)相比,沉默d CK后,随着照射剂量的增加,细胞的克隆形成率明显减少,D0值分别为2.35(p SUPER),2.01(d CKRi),提示沉默d CK增加He La细胞的辐射敏感性。将稳定转染p SUPER、d CKRi载体的SKBR3,MDA-MB-231细胞给予8Gy照射(IR),流式细胞术检测发现,IR诱导MDA-MB-231细胞死亡率明显高于SKBR3细胞。经过IR处理,SKBR3-p SUPER,SKBR3-d CKRi细胞死亡率分别增加了141%,169%;MDA-MB-231-p SUPER,MDA-MB-231-d CKRi细胞死亡率增加了302%,355%,提示沉默d CK增加IR诱导的乳腺癌细胞死亡,并且MDA-MB-231细胞比SKBR3细胞辐射敏感性强。2.d CK Ser-74位点的磷酸化抑制IR诱导的细胞死亡将沉默d CK的细胞分别转染Vector,d CK-WT(野生型d CK),d CK-S74A(Ser-74位点突变成丙氨酸,属于低磷酸化型d CK),d CK-S74E(Ser-74位点突变成谷氨酸,属于过磷酸化型d CK),8Gy照射后沉默d CK的He La细胞生存率减少至60.79%,而过表达d CK可明显逆转IR诱导的细胞死亡,生存率由高到低分别为d CK-S74E(93.58%)>d CK-WT(81.93%)>d CK-S74A(69.93%)。沉默d CK的SKBR3与MDA-MB-231细胞经过8Gy照射处理,细胞死亡率分别增加了129%,366%。而过表达d CK可明显降低IR诱导的细胞死亡,在SKBR3的细胞模型中,细胞死亡率增加幅度由高到低分别为d CK-S74A(137%)>d CK-WT(90%)>d CK-S74E(65%);在MDA-MB-231的细胞模型中,细胞死亡率增加幅度由高到低分别为d CK-S74A(357%)>d CK-WT(320%)>d CK-S74E(195%)。以上结果提示,d CK Ser74位点的磷酸化可增加细胞的辐射抗性。3.d CK参与IR诱导多种细胞死亡将稳定转染p SUPER、d CKRi载体的He La细胞分别给予3-MA,Rapamycin,ZVAD-FMK,Necrostatin-1,Ferrostatin-1,加药1h后经过8Gy照射,与control组相比,3-MA明显增加了IR诱导的细胞死亡,其中p SUPER细胞死亡率增加了29%,d CKRi细胞死亡率增加了25%。Rapamycin和ZVAD-FMK明显降低了IR诱导的细胞死亡。但Ferrostatin-1和Necrostatin对IR诱导的细胞死亡无显著影响。在SKBR3细胞模型中,3-MA对IR诱导的细胞死亡无明显改变,而Rapamycin能够明显增加IR诱导的细胞死亡,其中p SUPER增加了42%,d CKRi增加了55%。ZVAD-FMK组经过IR处理,d CKRi细胞死亡率明显减少,而p SUPER细胞死亡率无明显变化。在MDA-MB-231细胞模型中,3-MA和ZVAD-FMK能够明显降低IR诱导的细胞死亡,而Rapamycin能够明显增加IR诱导的细胞死亡,其中p SUPER增加了64%,d CKRi增加了40%。以上结果提示d CK对中等剂量辐射诱导的细胞死亡有自噬、凋亡有的参与,而与坏死、铁死亡无关。4.d CK Ser-74位点参与抑制凋亡将稳定转染p SUPER、d CKRi载体的He La细胞经过8Gy照射发现,IR能明显增加细胞凋亡率,并且He La-d CKRi(20.92%)>He La-p SUPER(14.98%)。此外,IR能明显增加Ceaved-caspase3/caspase3,其中p SUPER增加了134%,d CKRi增加了214%。沉默d CK和IR均可引起Bcl-2蛋白表达水平的减少。在SKBR3,MDA-MB-231的细胞模型中,IR能够明显Cleaved-PARP/PARP,并且SKBR3-d CKRi(1.92)>SKBR3-p SUPER(1.20),MDA-MB-231-d CKRi(3.61)>MDAMB-231-p SUPER(1.42)。提示沉默d CK可以增加IR诱导的细胞的凋亡水平。将He La,SKBR3,MDA-MB-231的各组d CK过表达细胞模型经过8Gy照射发现,在He La细胞模型中,IR诱导的细胞凋亡增加比例由高到低分别d CK-Vector(88%)>d CK-S74A(50%)>d CK-WT(29%)>d CK-S74E(26%);在SKBR3的细胞模型中,IR诱导的细胞凋亡增加比例由高到低分别为d CK-S74A(107%)>d CK-Vector(101%)>d CK-WT(64%)>d CK-S74E(42%);在MDA-MB-231的细胞模型中,IR诱导的细胞凋亡增加比例由高到低分别为d CK-Vector(463%)>d CK-S74A(293%)>d CK-WT(190%)>d CK-S74E(无变化)。以上结果提示,d CK通过Ser-74位点的磷酸化抑制IR诱导的细胞凋亡。5.d CK Ser-74位点参与促进自噬将He La-p SUPER和He La-d CKRi细胞给予NH4Cl(30m M)和8Gy照射处理。IR 72h p SUPER细胞MAPLC3-II蛋白表达量与假照组相比明显增加,而IR 24h,48h LC3-II表达不明显,提示IR可引起细胞自噬呈时间依赖性增加。加入NH4Cl能明显增加LC3-II的表达水平。与He La-d CKRi相比,He La-p SUPER在IR 72h LC3-II表达较高。流式细胞术结果显示,IR诱导的He La-d CKRi自噬水平(14.76%)明显低于He La-p SUPE自噬水平(25.31%)。沉默d CK的SKBR3,MDA-MB-231细胞模型给予8Gy照射,SKBR3-p SUPER细胞的LC3-II/GAPDH增加了52%,而SKBR3-d CKRi细胞的LC3-II/GAPDH变化不明显。MDA-MB-231-p SUPER细胞的LC3-II/GAPDH增加了91%,而MDA-MB-231-d CKRi细胞的LC3-II/GAPDH仅增加了36%。以上结果提示d CK可增加IR诱导的细胞自噬水平。将过表达d CK的He La,SKBR3,MDA-MB-231细胞模型给予8Gy照射发现,过表达d CK可明显增加IR诱导LC3-II的水平。在He La细胞模型中,LC3-II增加水平由高到低分别为S74E(46%)>WT(44%)>Vector(16%)>S74A(9%)。在MDA-MB-231细胞模型中,LC3-II增加水平由高到低分别为S74E(342%)>WT(306%)>S74A(145%)>Vector(无变化)。在SKBR3细胞中,IR可引起d CK-S74E细胞LC3-II表达明显增加(65%),而其他组细胞模型的LC3-II IR前后LC3-II变化不明显。以上结果提示过表达d CK可以增加IR诱导的细胞自噬,并且d CK Ser-74位点的磷酸化参与了自噬的调控。6.d CK通过Akt/m TOR/P70S6K通路调控自噬将过表达d CK的He La,MDA-MB-231细胞给予8Gy照射,Western blot检测Akt/m TOR/P70S6K通路各蛋白显示,在He La-d CK-WT细胞中,IR处理后phospho-Akt/Akt/GAPDH降低了54%,phospho-m TOR/m TOR/GAPDH降低了39%phospho-P70S6K/P70S6K/GAPDH降低了31%。在He La-d CK-S74E细胞中,IR处理后phospho-Akt/Akt/GAPDH降低了57%,phospho-m TOR/m TOR/GAPDH降低了55%,phospho-P70S6K/P70S6K/GAPDH降低了46%。但He La-d CK-S74A细胞中,IR前后Akt/m TOR/P70S6K通路各蛋白变化不明显。在转染野生型d CK的MDA-MB-231细胞中,IR处理后phospho-Akt/GAPDH降低了54%,phospho-m TOR/GAPDH降低了82%,phospho-P70S6K/GAPDH降低了54%。在转染d CK-S74E的MDA-MB-231细胞中,IR处理后phospho-Akt/GAPDH降低了57%,phospho-m TOR/GAPDH降低了87%,phospho-P70S6K/GAPDH降低了64%。但在转染d CK-S74A的MDA-MB-231细胞中,IR处理后phospho-Akt/GAPDH,phospho-m TOR/GAPDH,phospho-P70S6K/GAPDH仅分别降低了19%,38%和7%。以上结果提示d CK通过Akt/m TOR/P70S6K通路调控IR诱导的细胞自噬。7.自噬与凋亡的转换将He La-p SUPER,He La-d CKRi细胞分别经3-MA,ZVAD-FMK或3-MA+ZVAD-FMK预处理1h后给予8Gy照射,Western blot检测caspase-3及cleaved-caspase3蛋白水平显示,3-MA可显著增加各组细胞凋亡水平,其中He La-d CKRi细胞IR诱导的凋亡水平最高。细胞经3-MA+ZVAD-FMK共同处理后,凋亡水平明显低于3-MA处理组中其相应凋亡水平,明显高于ZVAD-FMK处理组中相应凋亡水平。流式细胞术结果显示,3-MA可明显增加IR诱导细胞的凋亡水平,其中He La-p SUPER凋亡增加了32%,He La-d CKRi凋亡增加了48%。He La-d CKRi细胞中,ZVAD-FMK可明显抑制IR诱导的细胞凋亡(24%),加入3-MA+ZVAD-FMK共同处理后,与control组细胞相比,IR诱导的细胞凋亡无明显变化,提示3-MA对凋亡的促进作用和ZVAD-FMK对凋亡的抑制作用相互抵消。流式细胞术检测细胞凋亡发现,在MDA-MB-231的细胞模型中,3-MA可明显抑制IR诱导的细胞凋亡。沉默d CK后,Rapamycin可明显增加IR诱导的细胞凋亡(32%),而在p SUPER细胞中Rapamycin对IR诱导的凋亡的促进作用不明显。通过Western blot检测凋亡相关蛋白发现,沉默d CK使IR诱导的细胞凋亡增加了17%,加入自噬抑制剂3-MA可显著抑制细胞凋亡水平,其中沉默d CK的细胞经过IR处理后凋亡水平降低最显著(43%)。此外,3-MA+ZVAD-FMK可明显抑制细胞凋亡水平,其抑制作用高于3-MA,ZVAD-FMK单独处理组。提示抑制自噬可抑制IR诱导的细胞凋亡水平,并且3-MA和ZVAD-FMK可协同抑制细胞凋亡。8.d CK通过调控G2/M期检查点保护细胞免于有丝分裂灾难流式细胞术对He La-p SUPER,He La-d CKRi细胞周期相关指标进行检测发现,IR可引起细胞G2/M期阻滞,并且G2/M期阻滞具有时间依赖性,在IR处理12h后达到顶峰。此时,沉默d CK后,IR诱导的G2/M期细胞数明显低于p SUPER细胞数。IR能够促进d CK与Cdk1的结合,并抑制Cdk1的活性,而d CK Ser74位点的磷酸化对Cdk1活性的抑制具有重要作用。p SUPER细胞经过IR处理12h后,有丝分裂细胞减少了70%,在IR处理24h后有所恢复。而在IR处理12h后,沉默d CK对于有丝分裂细胞数影响很小,但IR诱导的多倍体显著增加(204%)。此外,沉默d CK可进一步增加IR诱导H2AX的表达,并抑制ERCC1表达。以上结果提示d CK通过调控G2/M期检查点保护细胞免于有丝分裂灾难。结论:1.沉默d CK促进IR诱导的细胞死亡,从而辐射增敏。2.d CK Ser-74位点的磷酸化抑制IR诱导的细胞死亡,具体体现在抑制IR诱导的细胞凋亡,促进IR诱导的细胞自噬,其中自噬与凋亡存在转换关系。3.d CK通过Akt/m TOR/P70S6K通路调控IR诱导的细胞自噬。4.d CK通过调控G2/M期检查点保护细胞免于有丝分裂灾难。