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目前多重耐药情况频发,新型的抗生素——甘氨酰四环素类抗生素替加环素被视为抵御多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后防线。随着我国科研工作者在鲍曼不动杆菌和大肠杆菌中鉴定出质粒介导的替加环素耐药基因tet（X3）和tet（X4）,通过接合能在不同的细菌之间转移,从而加剧替加环素耐药基因的传播,越来越多的研究聚焦于探索tet（X）基因。然而,tet（X）的起源目前未知,基于对tet（X）基因数据库溯源,本研究发现tet（X）多存在于鸭疫里默氏杆菌中。鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestife）是一种黄杆菌科细菌,它可以感染多种家禽,包括鸭、鹅、鸡和火鸡,导致它们患上急性或慢性败血症。因此,本文旨在探究鸭疫里默氏杆菌中tet（X）基因的流行分布和耐药机制,包括对解析出的一个多重耐药质粒和新型甲氧苄啶耐药基因进行分析。首先,本研究从2016年到2020年期间采集自江苏省和广东省不同养殖场的鸡、鸭、鹅病料中共分离鉴定出139株鸭疫里默氏杆菌,发现分离株对四环素的耐药率为100%,tet（X）基因的检出率为100%。其中江苏分离株（38株）,13.16%来自鸡源,23.68%来自鸭源,63.16%来自鹅源;广东分离株（101株）全部来自于鹅源。其中江苏分离株（38株）对多西环素、氨苄青霉素、卡那霉素、氟苯尼考、替加环素、红霉素的耐药率分别为86.8%、39.5%、65.8%、50%、55.3%和89.5%;广东分离株（101株）对这些抗生素的耐药率分别为90%、63%、96%、27%、2%和91.8%。耐药基因检出率方面,除了tet（X）基因外,floR和ermF基因检出率最高,floR检出率分别为55.3%和81%,ermF检出率分别为89.5%和89.1%,也有少量ereD基因和插入序列ISCR2被检出。接合试验表明,鸭疫里默氏杆菌无论是作为供体菌还是受体菌,均存在宿主限制性,在目前的试验条件下,tet（X）无法通过接合转移的方式进行跨种属传播。随后,本研究选取了对替加环素耐药率更高的江苏分离株,着重分析了 38株tet（X）阳性鸭疫里默氏杆菌的基因组学特征,结果显示,tet（X）基因定位的可变区均位于保守区域rsmB-wzx和czcD-dam之间,该类基因环境共计12种。另一类基因环境为floR-ISCR2-tet（X）的经典结构。本研究从鸭疫里默氏杆菌的染色体上发现13个tet（X）新变体,分别是 tet（X17）、tet（X16）、tet（X18）、tet（X19）、tet（X20）和tet（X21）及其余已报道变体的突变体,这些tet（X）变体均能介导大肠杆菌BL21（DE3）对替加环素的耐药,同时也影响了对四环素、米诺环素、土霉素和多西环素的敏感性,也包括对FDA新批准使用的依拉环素和奥玛环素。通过从对含单拷贝tet（X）的替加环素耐药菌和敏感菌的药物刺激,本研究发现20190403E1-1株tet（X17.2）的mRNA水平和20190502E1-H1株tet（X20）的mRNA水平均会随着替加环素刺激浓度的增加而提高。当替加环素刺激浓度为8 mg/L时,tet（X17.2）和tet（X20）的mRNA水平均达到最高值。随后利用自杀质粒pRE112和本研究构建的穿梭质粒pTRA01分别完成了鸭疫里默氏杆菌中tet（X）基因的敲除和回补,结果证明tet（X）基因确实是调控原菌对四环素类抗生素产生抗性的基因。接着,根据药物压力诱导突变株的结果,我们判断鸭疫里默氏杆菌的染色体上存在某种调控tet（X）基因表达的机制,且染色体上tet（X）基因拷贝数的增加会提高鸭疫里默氏杆菌对替加环素的抗性水平,最高可提升16倍以上。tet（X）基因与同属黄杆菌科的鸭疫里默氏杆菌的GC含量相似,这也提示鸭疫里默氏杆菌可能是tet（X）的源头宿主,而敏感或低水平抗性菌株的tet（X）基因可能为其成为替加环素抗性基因的天然储库提供更大竞争力,这需要更进一步的研究来提供证据。最后,通过三代测序技术和生物信息学平台,本研究成功解析了鸭疫里默氏杆菌20190305E2-2中的多重耐药质粒p20190305E2-22,它具有多种耐药基因,包括dfrA49、tet（X18）、catB、ermF、ereD、Δarr和blaOXA。dfrA49是从该质粒上鉴定出的具有甲氧苄啶抗性的新型耐药基因,能介导大肠杆菌BL21（DE3）对甲氧苄啶的高水平耐药,使MIC提高了至少256倍。据我们所知,这是鸭疫里默氏杆菌中第一次有dfrA家族的基因报道。通过基因环境分析,dfrA49始终与catB基因共存,此结构目前仅在黄杆菌科细菌中发现。通过线性比对,本研究总结了 9种不同的dfrA49-catB遗传环境。本研究还发现,p20190305E2-22中的dfrA49-catB结构可能被IS4351-tet（X18）打断,这一现象表明dfrA49与catB之间可能存在插入热点。基于潜在的插入热点,携带dfrA49-catB结构的宿主存在ARGs转移和富集的风险。综上,本研究阐明了鸭疫里默氏杆菌中替加环素耐药基因tet（X）的流行分布及耐药机制,借助二、三代测序技术,解析了鸭疫里默氏杆菌基因组中tet（X）和dfra49-catB的基因环境,验证了tet（X）新变体和新型甲氧苄啶耐药基因dfrA49的功能,对含有单拷贝tet（X）的菌株如何调控对替加环素的抗性这一问题提供了新思路。基于tet（X）在鸭疫里默氏杆菌中的高度流行,其通过鸭疫里默氏杆菌传播给其他临床病原菌的风险值得更进一步研究。