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I群禽腺病毒血清4型属于禽腺病毒科腺病毒属，可在鸡群中潜伏感染，主要引起3~5周龄的肉鸡发病，表现为突然死亡或伴有心包积液及肝炎为特征的心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium hepatitissyndrome,HHS)。该病于1987年8月首次报道发生于巴基斯坦安卡拉地区，故又称“安卡拉”病。随后美国、印度、加拿大、匈牙利、日本、韩国和波兰等国家先后有该病的报道。我国自2012年以来，地方流行性包涵体肝炎在各省大面积流行，其死亡率约为10%~30%。而到2015年，该病死亡率高达30%-90%。资料显示2016年以来国内主要流行株为C、D（4型和10型）、E株。本研究以本实验室分离得到的疑似I群禽腺病毒血清4型毒株为对象，旨在确定疑似禽腺病毒陕西地区分离株的相关基因特征，并建立针对I群禽腺病毒的PCR诊断方法，同时利用原核表达系统获得具有生物活性的可溶性Penton蛋白。 1.禽腺病毒陕西分离株关键基因的克隆及序列分析 本研究通过PCR技术对疑似I群禽腺病毒血清4型毒株的6个基因片段Hexon、Penton、Fiber-1、Fiber-2、33K和pIIIa进行克隆扩增，并分别连接至pCold-SUMO载体。酶切鉴定结果显示成功构建6个重组质粒。再进行测序并分析，将克隆得到的6个基因片段与GenBank中发表的17株腺病毒不同血清型相应核苷酸序列和及推导的氨基酸序列进行对比，结果表明所克隆得到的6个片段均与I群禽腺病毒4型同源性最高。与4型腺病毒的对比结果为：Hexon基因核苷酸同源性在99.9％~100％，氨基酸同源性在99.9％~100％；Penton基因核苷酸同源性在99.9％~100％，氨基酸同源性均为100％；33K基因核苷酸同源性在99.3％~100％，氨基酸同源性在91.5％~100％；Fiber-1基因核苷酸同源性在98.5％~100％，氨基酸同源性在65.9％~100％；Fiber-2基因核苷酸同源性在98.1％~100％，氨基酸同源性在99.3％~100％；pⅢa基因核苷酸同源性在98.6％~100％，氨基酸同源性在98.5％~100％。遗传进化树分析结果显示这些基因在遗传关系上与血清4型位于同一分支，亲缘关系最近，分析显示陕西分离株为I群禽腺病毒血清4型。 2.I群禽腺病毒PCR检测方法的建立 根据GenBank已公布的Hexon的保守序列设计检测I群禽腺病毒的PCR鉴定引物，优化PCR反应条件。退火温度在55℃~65℃均能扩增出目的条带且效果理想，在53.4℃时扩增结果最佳。特异性试验结果表明，经此PCR方法扩增FAdV-4结果为阳性，而CIAV、EDSV、ILTV、MDV均为阴性，显示出高特异性。敏感性试验结果表明，将4型腺病毒稀释101~105倍分别PCR扩增，电泳结果显示模板浓度在3.02×10-2ng/μL时仍然有明显的特异性条带，表明该方法的灵敏度高且最低可检测出病毒DNA含量为3.02×10-2ng/μL。 3.Penton蛋白的原核表达和纯化及基于Penton蛋白间接ELISA方法的初探将本研究构建的pCold-SUMO-Penton重组质粒转化至大肠杆菌DE3中原核表达，并使用IPTG诱导。在IPTG浓度为1mmol/L，15℃诱导表达18h，SDS-PAGE及Westernblot结果显示蛋白高效可溶性表达，分离纯化后得到蛋白浓度高达240μg/mL。ELISA结果显示与FAdV阳性血清反应良好，可作为良好的诊断抗原为后续研究提供平台。为此，将纯化后的Penton蛋白包被，进行间接ELISA试验，初步确定了ELISA试验的抗原最佳包被浓度为50μg/mL，血清最佳稀释度为1:200。