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狼疮性肾炎(lupus nephrits,LN)是系统性红斑狼疮最常见和最严重的并发症之一,也是系统性红斑狼疮致残与致死的重要原因之一。LN的病理变化多种多样。肾小球系膜细胞过度增殖是LN主要的病变特点。增殖的系膜细胞可以进一步释放炎症因子、分泌细胞外基质,最终引起肾小球硬化。因此,明确系膜细胞具体损伤机制,探索新手段抑制其进展显得尤为重要。
本研究拟以狼疮性肾炎(lupus nephrits,LN)患者、MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾组织和人系膜细胞(human mesangial cell,HMC)为研究对象,探讨三结构域蛋白27(tripartite motif protein 27, TRIM27)及其相关信号通路在狼疮性肾炎肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积中的作用及其可能机制,为进一步揭示狼疮性肾炎的发病机制,并为探索靶向治疗的方法提供实验依据。具体实验分为以下四部分:
第一部分狼疮性肾炎患者中TRIM27过表达参与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积
目的:
本部分以狼疮患者活检肾脏组织为研究对象,检测TRIM27在肾组织中的表达及定位改变,分析与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积的关系。
方法:
以因肾肿瘤切除的肿瘤远端组织作为对照组,LN肾组织为狼疮性肾炎组,HE和PAS染色观察肾组织形态学改变;免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)检测肾小球TRIM27、PCNA和CollagenⅣ的表达,分析TRIM27与LN细胞增殖和ECM沉积之间的关系。
结果:
HE结果显示,与control组相比,LNⅢ和LNⅣ患者肾小球体积增大,细胞数目明显增多;PAS染色结果显示,基底膜增厚,系膜区增宽,基质明显增多。
IHC结果显示,在control组肾小球中,TRIM27主要定位于肾小球细胞的细胞核中,而在LNⅢ和LNⅣ患者肾小球中,TRIM27则同时表达于肾小球细胞的胞核和胞浆以及系膜增殖区,表达水平明显增强;PCNA和CollagenⅣ在LNⅢ和LNⅣ患者肾小球中表达亦明显增强;且与肾小球中TRIM27表达呈显著正相关。
结论:
LN患者肾小球中TRIM27表达增高并出现定位改变,与肾小球细胞增殖和ECM沉积呈显著正相关。
第二部分MRL/lpr小鼠中TRIM27表达参与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积
目的:
本部分以MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠为研究对象,检测敲低肾脏TRIM27表达后对肾小球细胞增殖水平和尿蛋白的影响。
方法:
14周龄雌性MRL/lpr小鼠随机分为MRL/lpr组,MRL/lpr+Sh-TRIM27组和MRL/lpr+Sh-NC组,并取同周龄、同性别的MRL/MPJ设为control组,将重组腺相关病毒(Sh-TRIM27-AAV/Sh-NC-AAV)原位注射至小鼠肾脏,10周后留取血、尿标本,处死小鼠收集肾脏组织,免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)、real-timePCR、蛋白印迹技术(western blot, WB)观察转染效率和沉默效果,HE、PAS进行常规病理学观察,IF检测IgG沉积情况,IHC技术检测PCNA、p27、CollagenⅣ、PAI-1蛋白在肾组织中的表达,WB检测PAI-1、p27蛋白的表达,生化分析仪测定血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)、24h尿蛋白等生化指标。
结果:
1.原位注射技术可有效的将Sh-TRIM27-AAV感染至小鼠肾皮质:荧光显微镜下观察冰冻切片,结果表明,原位注射AAV后2周、4周、8周和10周后在小鼠肾皮质均有荧光表达。
2.Sh-TRIM27-AAV有效下调狼疮鼠肾皮质TRIM27mRNA和蛋白表达
Real-timePCR、WB结果显示,与MRL/lpr小鼠相比,MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾组织的TRIM27mRNA和蛋白水平明显降低。
3.敲低TRIM27表达能够降低狼疮鼠肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积水平
HE和PAS结果显示,与control组相比,MRL/lpr组小鼠肾小球体积增大,细胞数目明显增多,基底膜明显增厚,系膜区明显增宽,MRL/lpr+Sh-TRIM27组肾小球体积减小,细胞数目有所减少,基底膜增宽不明显,系膜区增宽水平明显降低;IHC和WB结果显示,与control组相比,MRL/lpr组小鼠细胞处于过度增殖状态,ECM沉积明显增加,敲低TRIM27后抑制了细胞增殖水平,降低了ECM沉积水平。
生化检测结果显示,与control组小鼠相比,MRL/lpr组小鼠24h尿蛋白量明显增加;与MRL/lpr组相比,MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠24h尿蛋白量有所降低,血肌酐和血尿素水平在四组间均无明显差异。
结论:
抑制MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾皮质TRIM27的表达,可有效降低肾小球细胞的增殖和细胞外基质沉积水平,改善小鼠尿蛋白。
第三部分TRIM27通过FoxO1介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和ECM分泌
目的:
本研究以狼疮性肾炎患者、MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾组织和体外培养的HMC为研究对象,检测TRIM27的促增殖作用,并检测相关下游信号通路的活化。
方法:
1.IHC检测对照组和LN患者肾组织中p-FoxO1-Ser256的表达。
2.小鼠随机分为control组,MRL/lpr组,MRL/lpr+Sh-TRIM27组和MRL/lpr+Sh-NC组,IHC检测肾小球FoxO1的表达,WB检测p-FoxO1-Ser256蛋白水平。
3.以HMC为研究对象,给予LN患者置换血浆刺激后,检测TRIM27表达及对HMC增殖和ECM分泌的影响及其作用机制
⑴1%,3%,5%LN患者置换血浆或同比例健康正常人血浆刺激HMC,CCK8方法检测细胞增殖水平,westernblot技术检测p27和PAI-1蛋白水平。
⑵5%健康人或LN患者置换血浆刺激HMC,westernblot方法检测TRIM27蛋白的表达;免疫荧光技术检测TRIM27蛋白定位情况。
⑶HMC随机分为对照组(control)、狼疮性肾炎组(LN)、质粒转染组(LN+Sh-TRIM27)和转染对照组(LN+NC),细胞融合50%时转染质粒,孵育36h后,加入5%健康人或LN患者置换血浆刺激,12h和48h后分别收集细胞和培养的上清,real-timePCR技术检测TRIM27mRNA的表达,westernblot方法检测TRIM27、p27和PAI-1蛋白的表达。流式细胞术、EdU掺入法检测细胞增殖水平,ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
⑷5%健康人或LN患者置换血浆刺激HMC,westernblot方法检测FoxO1,p-FoxO1-Ser256蛋白水平,免疫荧光技术检测FoxO1蛋白定位情况。
⑸HMC随机分为上述四组,westernblot方法检测FoxO1,p-FoxO1-Ser256蛋白水平,免疫荧光技术检测FoxO1蛋白定位情况。
⑹HMC随机分为对照组(control),狼疮性肾炎组(LN),FoxO1转染组(LN+WT-FoxO1)和FoxO1转染对照组(LN+NC),westernblot方法检测FoxO1、p27和PAI-1蛋白水平,流式细胞术、EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平,ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
⑺细胞随机分为对照组(control),狼疮性肾炎组(LN),出核抑制剂组(LN+LMB),溶剂对照组(LN+ET),以5nMleptomycinB或无水乙醇预处理12h,5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞后收集细胞,免疫荧光检测TRIM27定位情况;westernblot方法检测FoxO1、p27和PAI-1蛋白表达;EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平,ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
结果:
1.p-FoxO1在狼疮性肾炎患者肾小球中表达明显升高
IHC结果显示,control组肾小球中p-FoxO1蛋白表达较低,狼疮性肾炎患者肾小球中p-FoxO1表达明显增强。
2.MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾皮质中敲低TRIM27表达能够影响FoxO1表达
IHC结果显示,control组小鼠肾小球中,FoxO1蛋白主要定位于细胞核,MRL/lpr小鼠肾小球中FoxO1蛋白表达明显降低,MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾小球中FoxO1蛋白表达有所恢复;westernblot结果表明,与control组小鼠相比,MRL/lpr小鼠肾皮质中p-FoxO1蛋白水平明显增强,MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾皮质中p-FoxO1蛋白水平有所下调。
3.TRIM27通过FoxO1介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和ECM分泌
⑴LN患者置换血浆能够促进HMC增殖
CCK8结果显示,刺激细胞12h后,与含1%、3%和5%健康人血浆刺激组相比,同比例LN患者置换血浆刺激HMC后,细胞增殖水平明显升高,且5%LN患者置换血浆促增殖作用最明显。Westernblot结果显示LN患者置换血浆刺激HMC后p27蛋白水平明显降低,PAI-1蛋白水平显著升高。
⑵LN患者置换血浆刺激HMC后TRIM27表达水平明显增高
Westernblot结果显示,LN患者置换血浆刺激HMC后TRIM27蛋白水平明显增高。免疫荧光结果显示,control组TRIM27主要定位于细胞核,给予LN患者置换血浆刺激后除细胞核外,胞浆中TRIM27阳性信号明显增强。
⑶敲低TRIM27表达能够降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用,减少ECM分泌量
Real-timePCR和westernblot结果显示,与NC组相比,Sh-TRIM27组TRIM27mRNA和蛋白水平均明显降低。
FCM结果显示,与control组相比,LN组S期细胞比例明显增加,G0/G1期细胞比例降低,敲低TRIM27后,S期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例升高;EdU掺入结果显示,LN组EdU阳性细胞百分比较control组显著增加,敲低TRIM27后,EdU阳性细胞百分比有所下降;westernblot结果显示,与control组相比,LN组PAI-1蛋白表达水平明显增高,p27表达水平明显降低,敲低TRIM27后,PAI-1蛋白表达水平明显降低,p27降低水平有所恢复;ELISA结果显示,LN组细胞上清中CollagenⅣ蛋白水平较control组明显增加,敲低TRIM27后,其水平明显降低。
⑷FoxO1蛋白在LN患者置换血浆刺激的HMC中失活
给予LN置换血浆刺激后p-FoxO1蛋白表达明显增高,FoxO1蛋白水平明显降低;免疫荧光结果提示,control组FoxO1主要定位于细胞核,给予LN患者置换血浆刺激后FoxO1从胞核转运至胞浆。
⑸TRIM27通过FoxO1参与LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用:westernblot结果表明,与LN+NC组相比,LN+Sh-TRIM27组FoxO1蛋白表达升高,而p-FoxO1蛋白表达降低;IF结果显示,与LN+NC组相比,LN+Sh-TRIM27组FoxO1在细胞浆中表达降低,细胞核中的阳性表达有所恢复。
⑹上调FoxO1表达能够有效降低LN置换血浆对HMC的促增殖作用,减少ECM分泌水平
westernblot结果表明,与LN组相比,LN+WT-FoxO1组FoxO1蛋白水平明显上调。
FCM、EdU掺入、westernblot、ELISA结果显示,过表达FoxO1后,可以降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用,减少ECM分泌量。
⑺抑制TRIM27出核后能够降低LN患者置换血浆引起的HMC增殖和ECM分泌
IF结果显示,给予LN患者置换血浆刺激后除细胞核外,胞浆中TRIM27阳性信号明显增强,LMB预处理后胞浆中TRIM27阳性信号明显减少。
EdU掺入、westernblot、ELISA结果显示,抑制TRIM27出核后,可以降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用,减少ECM分泌量。
结论:
LN患者置换血浆能够上调HMC增殖和ECM分泌水平;敲低TRIM27的表达,可有效抑制LN置换血浆所致的HMC过度增殖和ECM分泌,这种作用通过调节FoxO1蛋白水平实现。
第四部分Akt调节TRIM27/FoxO1信号通路介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和细胞外基质沉积
目的:
本部分研究以体外培养的HMC为研究对象,明确Akt与TRIM27的上下游关系。
方法:
1.HMC接种于6孔板后,5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞,westernblot方法检测Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白表达。
2.HMC随机分为control组、LN组、LN+LY294002组和LN+DMSO组。以20μMLY294002或DMSO孵育1h后,5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞,westernblot方法检测Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308、TRIM27、FoxO1、p27和PAI-1蛋白表达;免疫荧光检测TRIM27定位情况;流式细胞术、EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平,ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
3.HMC随机分为control组、LN组、LN+Sh-TRIM27组和LN+NC组。westernblot方法检测TRIM27、Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白的表达。
结果:
1.LN患者置换血浆能够激活HMC中PI3K/Akt信号通路
Westernblot结果显示,LN患者置换血浆刺激HMC30min后p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平明显增高,Akt蛋白水平未见明显改变。
2.抑制PI3K/Akt信号通路能够通过调节TRIM27介导LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用
Westernblot结果显示,抑制Akt信号通路能够显著减低Akt信号通路活化水平,同时TRIM27蛋白水平明显降低;IF显示,LN组中,TRIM27除胞核外,胞浆中阳性信号明显增强,给予LY294002后TRIM27蛋白在细胞浆中的阳性信号明显减少。
Westernblot、流式细胞术、EdU掺入法和ELISA检测结果显示,抑制Akt信号通路后能够显著降低LN患者置换血浆所诱导的HMC增殖和ECM分泌水平。
3.敲低TRIM27后对PI3K/Akt信号通路的影响
WB结果表明,与control组相比,LN组p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平有所升高,敲低TRIM27后p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平进一步升高;各组中Akt蛋白水平均未见明显改变。
结论:
狼疮性肾炎患者置换血浆可激活HMC中PI3K/Akt信号通路,活化的PI3K/Akt信号通路可能通过调控TRIM27表达和定位改变参与狼疮性肾炎系膜细胞的增殖和细胞外基质沉积。
本研究拟以狼疮性肾炎(lupus nephrits,LN)患者、MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾组织和人系膜细胞(human mesangial cell,HMC)为研究对象,探讨三结构域蛋白27(tripartite motif protein 27, TRIM27)及其相关信号通路在狼疮性肾炎肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积中的作用及其可能机制,为进一步揭示狼疮性肾炎的发病机制,并为探索靶向治疗的方法提供实验依据。具体实验分为以下四部分:
第一部分狼疮性肾炎患者中TRIM27过表达参与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积
目的:
本部分以狼疮患者活检肾脏组织为研究对象,检测TRIM27在肾组织中的表达及定位改变,分析与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积的关系。
方法:
以因肾肿瘤切除的肿瘤远端组织作为对照组,LN肾组织为狼疮性肾炎组,HE和PAS染色观察肾组织形态学改变;免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)检测肾小球TRIM27、PCNA和CollagenⅣ的表达,分析TRIM27与LN细胞增殖和ECM沉积之间的关系。
结果:
HE结果显示,与control组相比,LNⅢ和LNⅣ患者肾小球体积增大,细胞数目明显增多;PAS染色结果显示,基底膜增厚,系膜区增宽,基质明显增多。
IHC结果显示,在control组肾小球中,TRIM27主要定位于肾小球细胞的细胞核中,而在LNⅢ和LNⅣ患者肾小球中,TRIM27则同时表达于肾小球细胞的胞核和胞浆以及系膜增殖区,表达水平明显增强;PCNA和CollagenⅣ在LNⅢ和LNⅣ患者肾小球中表达亦明显增强;且与肾小球中TRIM27表达呈显著正相关。
结论:
LN患者肾小球中TRIM27表达增高并出现定位改变,与肾小球细胞增殖和ECM沉积呈显著正相关。
第二部分MRL/lpr小鼠中TRIM27表达参与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积
目的:
本部分以MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠为研究对象,检测敲低肾脏TRIM27表达后对肾小球细胞增殖水平和尿蛋白的影响。
方法:
14周龄雌性MRL/lpr小鼠随机分为MRL/lpr组,MRL/lpr+Sh-TRIM27组和MRL/lpr+Sh-NC组,并取同周龄、同性别的MRL/MPJ设为control组,将重组腺相关病毒(Sh-TRIM27-AAV/Sh-NC-AAV)原位注射至小鼠肾脏,10周后留取血、尿标本,处死小鼠收集肾脏组织,免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)、real-timePCR、蛋白印迹技术(western blot, WB)观察转染效率和沉默效果,HE、PAS进行常规病理学观察,IF检测IgG沉积情况,IHC技术检测PCNA、p27、CollagenⅣ、PAI-1蛋白在肾组织中的表达,WB检测PAI-1、p27蛋白的表达,生化分析仪测定血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)、24h尿蛋白等生化指标。
结果:
1.原位注射技术可有效的将Sh-TRIM27-AAV感染至小鼠肾皮质:荧光显微镜下观察冰冻切片,结果表明,原位注射AAV后2周、4周、8周和10周后在小鼠肾皮质均有荧光表达。
2.Sh-TRIM27-AAV有效下调狼疮鼠肾皮质TRIM27mRNA和蛋白表达
Real-timePCR、WB结果显示,与MRL/lpr小鼠相比,MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾组织的TRIM27mRNA和蛋白水平明显降低。
3.敲低TRIM27表达能够降低狼疮鼠肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积水平
HE和PAS结果显示,与control组相比,MRL/lpr组小鼠肾小球体积增大,细胞数目明显增多,基底膜明显增厚,系膜区明显增宽,MRL/lpr+Sh-TRIM27组肾小球体积减小,细胞数目有所减少,基底膜增宽不明显,系膜区增宽水平明显降低;IHC和WB结果显示,与control组相比,MRL/lpr组小鼠细胞处于过度增殖状态,ECM沉积明显增加,敲低TRIM27后抑制了细胞增殖水平,降低了ECM沉积水平。
生化检测结果显示,与control组小鼠相比,MRL/lpr组小鼠24h尿蛋白量明显增加;与MRL/lpr组相比,MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠24h尿蛋白量有所降低,血肌酐和血尿素水平在四组间均无明显差异。
结论:
抑制MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾皮质TRIM27的表达,可有效降低肾小球细胞的增殖和细胞外基质沉积水平,改善小鼠尿蛋白。
第三部分TRIM27通过FoxO1介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和ECM分泌
目的:
本研究以狼疮性肾炎患者、MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾组织和体外培养的HMC为研究对象,检测TRIM27的促增殖作用,并检测相关下游信号通路的活化。
方法:
1.IHC检测对照组和LN患者肾组织中p-FoxO1-Ser256的表达。
2.小鼠随机分为control组,MRL/lpr组,MRL/lpr+Sh-TRIM27组和MRL/lpr+Sh-NC组,IHC检测肾小球FoxO1的表达,WB检测p-FoxO1-Ser256蛋白水平。
3.以HMC为研究对象,给予LN患者置换血浆刺激后,检测TRIM27表达及对HMC增殖和ECM分泌的影响及其作用机制
⑴1%,3%,5%LN患者置换血浆或同比例健康正常人血浆刺激HMC,CCK8方法检测细胞增殖水平,westernblot技术检测p27和PAI-1蛋白水平。
⑵5%健康人或LN患者置换血浆刺激HMC,westernblot方法检测TRIM27蛋白的表达;免疫荧光技术检测TRIM27蛋白定位情况。
⑶HMC随机分为对照组(control)、狼疮性肾炎组(LN)、质粒转染组(LN+Sh-TRIM27)和转染对照组(LN+NC),细胞融合50%时转染质粒,孵育36h后,加入5%健康人或LN患者置换血浆刺激,12h和48h后分别收集细胞和培养的上清,real-timePCR技术检测TRIM27mRNA的表达,westernblot方法检测TRIM27、p27和PAI-1蛋白的表达。流式细胞术、EdU掺入法检测细胞增殖水平,ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
⑷5%健康人或LN患者置换血浆刺激HMC,westernblot方法检测FoxO1,p-FoxO1-Ser256蛋白水平,免疫荧光技术检测FoxO1蛋白定位情况。
⑸HMC随机分为上述四组,westernblot方法检测FoxO1,p-FoxO1-Ser256蛋白水平,免疫荧光技术检测FoxO1蛋白定位情况。
⑹HMC随机分为对照组(control),狼疮性肾炎组(LN),FoxO1转染组(LN+WT-FoxO1)和FoxO1转染对照组(LN+NC),westernblot方法检测FoxO1、p27和PAI-1蛋白水平,流式细胞术、EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平,ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
⑺细胞随机分为对照组(control),狼疮性肾炎组(LN),出核抑制剂组(LN+LMB),溶剂对照组(LN+ET),以5nMleptomycinB或无水乙醇预处理12h,5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞后收集细胞,免疫荧光检测TRIM27定位情况;westernblot方法检测FoxO1、p27和PAI-1蛋白表达;EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平,ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
结果:
1.p-FoxO1在狼疮性肾炎患者肾小球中表达明显升高
IHC结果显示,control组肾小球中p-FoxO1蛋白表达较低,狼疮性肾炎患者肾小球中p-FoxO1表达明显增强。
2.MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾皮质中敲低TRIM27表达能够影响FoxO1表达
IHC结果显示,control组小鼠肾小球中,FoxO1蛋白主要定位于细胞核,MRL/lpr小鼠肾小球中FoxO1蛋白表达明显降低,MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾小球中FoxO1蛋白表达有所恢复;westernblot结果表明,与control组小鼠相比,MRL/lpr小鼠肾皮质中p-FoxO1蛋白水平明显增强,MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾皮质中p-FoxO1蛋白水平有所下调。
3.TRIM27通过FoxO1介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和ECM分泌
⑴LN患者置换血浆能够促进HMC增殖
CCK8结果显示,刺激细胞12h后,与含1%、3%和5%健康人血浆刺激组相比,同比例LN患者置换血浆刺激HMC后,细胞增殖水平明显升高,且5%LN患者置换血浆促增殖作用最明显。Westernblot结果显示LN患者置换血浆刺激HMC后p27蛋白水平明显降低,PAI-1蛋白水平显著升高。
⑵LN患者置换血浆刺激HMC后TRIM27表达水平明显增高
Westernblot结果显示,LN患者置换血浆刺激HMC后TRIM27蛋白水平明显增高。免疫荧光结果显示,control组TRIM27主要定位于细胞核,给予LN患者置换血浆刺激后除细胞核外,胞浆中TRIM27阳性信号明显增强。
⑶敲低TRIM27表达能够降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用,减少ECM分泌量
Real-timePCR和westernblot结果显示,与NC组相比,Sh-TRIM27组TRIM27mRNA和蛋白水平均明显降低。
FCM结果显示,与control组相比,LN组S期细胞比例明显增加,G0/G1期细胞比例降低,敲低TRIM27后,S期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例升高;EdU掺入结果显示,LN组EdU阳性细胞百分比较control组显著增加,敲低TRIM27后,EdU阳性细胞百分比有所下降;westernblot结果显示,与control组相比,LN组PAI-1蛋白表达水平明显增高,p27表达水平明显降低,敲低TRIM27后,PAI-1蛋白表达水平明显降低,p27降低水平有所恢复;ELISA结果显示,LN组细胞上清中CollagenⅣ蛋白水平较control组明显增加,敲低TRIM27后,其水平明显降低。
⑷FoxO1蛋白在LN患者置换血浆刺激的HMC中失活
给予LN置换血浆刺激后p-FoxO1蛋白表达明显增高,FoxO1蛋白水平明显降低;免疫荧光结果提示,control组FoxO1主要定位于细胞核,给予LN患者置换血浆刺激后FoxO1从胞核转运至胞浆。
⑸TRIM27通过FoxO1参与LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用:westernblot结果表明,与LN+NC组相比,LN+Sh-TRIM27组FoxO1蛋白表达升高,而p-FoxO1蛋白表达降低;IF结果显示,与LN+NC组相比,LN+Sh-TRIM27组FoxO1在细胞浆中表达降低,细胞核中的阳性表达有所恢复。
⑹上调FoxO1表达能够有效降低LN置换血浆对HMC的促增殖作用,减少ECM分泌水平
westernblot结果表明,与LN组相比,LN+WT-FoxO1组FoxO1蛋白水平明显上调。
FCM、EdU掺入、westernblot、ELISA结果显示,过表达FoxO1后,可以降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用,减少ECM分泌量。
⑺抑制TRIM27出核后能够降低LN患者置换血浆引起的HMC增殖和ECM分泌
IF结果显示,给予LN患者置换血浆刺激后除细胞核外,胞浆中TRIM27阳性信号明显增强,LMB预处理后胞浆中TRIM27阳性信号明显减少。
EdU掺入、westernblot、ELISA结果显示,抑制TRIM27出核后,可以降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用,减少ECM分泌量。
结论:
LN患者置换血浆能够上调HMC增殖和ECM分泌水平;敲低TRIM27的表达,可有效抑制LN置换血浆所致的HMC过度增殖和ECM分泌,这种作用通过调节FoxO1蛋白水平实现。
第四部分Akt调节TRIM27/FoxO1信号通路介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和细胞外基质沉积
目的:
本部分研究以体外培养的HMC为研究对象,明确Akt与TRIM27的上下游关系。
方法:
1.HMC接种于6孔板后,5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞,westernblot方法检测Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白表达。
2.HMC随机分为control组、LN组、LN+LY294002组和LN+DMSO组。以20μMLY294002或DMSO孵育1h后,5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞,westernblot方法检测Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308、TRIM27、FoxO1、p27和PAI-1蛋白表达;免疫荧光检测TRIM27定位情况;流式细胞术、EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平,ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
3.HMC随机分为control组、LN组、LN+Sh-TRIM27组和LN+NC组。westernblot方法检测TRIM27、Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白的表达。
结果:
1.LN患者置换血浆能够激活HMC中PI3K/Akt信号通路
Westernblot结果显示,LN患者置换血浆刺激HMC30min后p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平明显增高,Akt蛋白水平未见明显改变。
2.抑制PI3K/Akt信号通路能够通过调节TRIM27介导LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用
Westernblot结果显示,抑制Akt信号通路能够显著减低Akt信号通路活化水平,同时TRIM27蛋白水平明显降低;IF显示,LN组中,TRIM27除胞核外,胞浆中阳性信号明显增强,给予LY294002后TRIM27蛋白在细胞浆中的阳性信号明显减少。
Westernblot、流式细胞术、EdU掺入法和ELISA检测结果显示,抑制Akt信号通路后能够显著降低LN患者置换血浆所诱导的HMC增殖和ECM分泌水平。
3.敲低TRIM27后对PI3K/Akt信号通路的影响
WB结果表明,与control组相比,LN组p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平有所升高,敲低TRIM27后p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平进一步升高;各组中Akt蛋白水平均未见明显改变。
结论:
狼疮性肾炎患者置换血浆可激活HMC中PI3K/Akt信号通路,活化的PI3K/Akt信号通路可能通过调控TRIM27表达和定位改变参与狼疮性肾炎系膜细胞的增殖和细胞外基质沉积。