论文部分内容阅读
狼疮性肾炎(lupus nephrits,LN)是系统性红斑狼疮最常见和最严重的并发症之一，也是系统性红斑狼疮致残与致死的重要原因之一。LN的病理变化多种多样。肾小球系膜细胞过度增殖是LN主要的病变特点。增殖的系膜细胞可以进一步释放炎症因子、分泌细胞外基质，最终引起肾小球硬化。因此，明确系膜细胞具体损伤机制，探索新手段抑制其进展显得尤为重要。
本研究拟以狼疮性肾炎(lupus nephrits,LN)患者、MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾组织和人系膜细胞(human mesangial cell,HMC)为研究对象，探讨三结构域蛋白27(tripartite motif protein 27, TRIM27)及其相关信号通路在狼疮性肾炎肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积中的作用及其可能机制，为进一步揭示狼疮性肾炎的发病机制，并为探索靶向治疗的方法提供实验依据。具体实验分为以下四部分：
第一部分狼疮性肾炎患者中TRIM27过表达参与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积
目的：
本部分以狼疮患者活检肾脏组织为研究对象，检测TRIM27在肾组织中的表达及定位改变，分析与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积的关系。
方法：
以因肾肿瘤切除的肿瘤远端组织作为对照组，LN肾组织为狼疮性肾炎组，HE和PAS染色观察肾组织形态学改变；免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)检测肾小球TRIM27、PCNA和CollagenⅣ的表达，分析TRIM27与LN细胞增殖和ECM沉积之间的关系。
结果：
HE结果显示，与control组相比，LNⅢ和LNⅣ患者肾小球体积增大，细胞数目明显增多；PAS染色结果显示，基底膜增厚，系膜区增宽，基质明显增多。
IHC结果显示，在control组肾小球中，TRIM27主要定位于肾小球细胞的细胞核中，而在LNⅢ和LNⅣ患者肾小球中，TRIM27则同时表达于肾小球细胞的胞核和胞浆以及系膜增殖区，表达水平明显增强；PCNA和CollagenⅣ在LNⅢ和LNⅣ患者肾小球中表达亦明显增强；且与肾小球中TRIM27表达呈显著正相关。
结论：
LN患者肾小球中TRIM27表达增高并出现定位改变，与肾小球细胞增殖和ECM沉积呈显著正相关。
第二部分MRL/lpr小鼠中TRIM27表达参与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积
目的：
本部分以MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠为研究对象，检测敲低肾脏TRIM27表达后对肾小球细胞增殖水平和尿蛋白的影响。
方法：
14周龄雌性MRL/lpr小鼠随机分为MRL/lpr组，MRL/lpr+Sh-TRIM27组和MRL/lpr+Sh-NC组，并取同周龄、同性别的MRL/MPJ设为control组，将重组腺相关病毒(Sh-TRIM27-AAV/Sh-NC-AAV)原位注射至小鼠肾脏，10周后留取血、尿标本，处死小鼠收集肾脏组织，免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)、real-timePCR、蛋白印迹技术(western blot, WB)观察转染效率和沉默效果，HE、PAS进行常规病理学观察，IF检测IgG沉积情况，IHC技术检测PCNA、p27、CollagenⅣ、PAI-1蛋白在肾组织中的表达，WB检测PAI-1、p27蛋白的表达，生化分析仪测定血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)、24h尿蛋白等生化指标。
结果：
1.原位注射技术可有效的将Sh-TRIM27-AAV感染至小鼠肾皮质：荧光显微镜下观察冰冻切片，结果表明，原位注射AAV后2周、4周、8周和10周后在小鼠肾皮质均有荧光表达。
2.Sh-TRIM27-AAV有效下调狼疮鼠肾皮质TRIM27mRNA和蛋白表达
Real-timePCR、WB结果显示，与MRL/lpr小鼠相比，MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾组织的TRIM27mRNA和蛋白水平明显降低。
3.敲低TRIM27表达能够降低狼疮鼠肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积水平
HE和PAS结果显示，与control组相比，MRL/lpr组小鼠肾小球体积增大，细胞数目明显增多，基底膜明显增厚，系膜区明显增宽，MRL/lpr+Sh-TRIM27组肾小球体积减小，细胞数目有所减少，基底膜增宽不明显，系膜区增宽水平明显降低；IHC和WB结果显示，与control组相比，MRL/lpr组小鼠细胞处于过度增殖状态，ECM沉积明显增加，敲低TRIM27后抑制了细胞增殖水平，降低了ECM沉积水平。
生化检测结果显示，与control组小鼠相比，MRL/lpr组小鼠24h尿蛋白量明显增加；与MRL/lpr组相比，MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠24h尿蛋白量有所降低，血肌酐和血尿素水平在四组间均无明显差异。
结论：
抑制MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾皮质TRIM27的表达，可有效降低肾小球细胞的增殖和细胞外基质沉积水平，改善小鼠尿蛋白。
第三部分TRIM27通过FoxO1介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和ECM分泌
目的：
本研究以狼疮性肾炎患者、MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾组织和体外培养的HMC为研究对象，检测TRIM27的促增殖作用，并检测相关下游信号通路的活化。
方法：
1.IHC检测对照组和LN患者肾组织中p-FoxO1-Ser256的表达。
2.小鼠随机分为control组，MRL/lpr组，MRL/lpr+Sh-TRIM27组和MRL/lpr+Sh-NC组，IHC检测肾小球FoxO1的表达，WB检测p-FoxO1-Ser256蛋白水平。
3.以HMC为研究对象，给予LN患者置换血浆刺激后，检测TRIM27表达及对HMC增殖和ECM分泌的影响及其作用机制
⑴1%，3%，5%LN患者置换血浆或同比例健康正常人血浆刺激HMC，CCK8方法检测细胞增殖水平，westernblot技术检测p27和PAI-1蛋白水平。
⑵5%健康人或LN患者置换血浆刺激HMC，westernblot方法检测TRIM27蛋白的表达；免疫荧光技术检测TRIM27蛋白定位情况。
⑶HMC随机分为对照组(control)、狼疮性肾炎组(LN)、质粒转染组(LN+Sh-TRIM27)和转染对照组(LN+NC)，细胞融合50%时转染质粒，孵育36h后，加入5%健康人或LN患者置换血浆刺激，12h和48h后分别收集细胞和培养的上清，real-timePCR技术检测TRIM27mRNA的表达，westernblot方法检测TRIM27、p27和PAI-1蛋白的表达。流式细胞术、EdU掺入法检测细胞增殖水平，ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
⑷5%健康人或LN患者置换血浆刺激HMC，westernblot方法检测FoxO1，p-FoxO1-Ser256蛋白水平，免疫荧光技术检测FoxO1蛋白定位情况。
⑸HMC随机分为上述四组，westernblot方法检测FoxO1，p-FoxO1-Ser256蛋白水平，免疫荧光技术检测FoxO1蛋白定位情况。
⑹HMC随机分为对照组(control)，狼疮性肾炎组(LN)，FoxO1转染组(LN+WT-FoxO1)和FoxO1转染对照组(LN+NC)，westernblot方法检测FoxO1、p27和PAI-1蛋白水平，流式细胞术、EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平，ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
⑺细胞随机分为对照组(control)，狼疮性肾炎组(LN)，出核抑制剂组(LN+LMB)，溶剂对照组(LN+ET)，以5nMleptomycinB或无水乙醇预处理12h，5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞后收集细胞，免疫荧光检测TRIM27定位情况；westernblot方法检测FoxO1、p27和PAI-1蛋白表达；EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平，ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
结果：
1.p-FoxO1在狼疮性肾炎患者肾小球中表达明显升高
IHC结果显示，control组肾小球中p-FoxO1蛋白表达较低，狼疮性肾炎患者肾小球中p-FoxO1表达明显增强。
2.MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾皮质中敲低TRIM27表达能够影响FoxO1表达
IHC结果显示，control组小鼠肾小球中，FoxO1蛋白主要定位于细胞核，MRL/lpr小鼠肾小球中FoxO1蛋白表达明显降低，MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾小球中FoxO1蛋白表达有所恢复；westernblot结果表明，与control组小鼠相比，MRL/lpr小鼠肾皮质中p-FoxO1蛋白水平明显增强，MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾皮质中p-FoxO1蛋白水平有所下调。
3.TRIM27通过FoxO1介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和ECM分泌
⑴LN患者置换血浆能够促进HMC增殖
CCK8结果显示，刺激细胞12h后，与含1%、3%和5%健康人血浆刺激组相比，同比例LN患者置换血浆刺激HMC后，细胞增殖水平明显升高，且5%LN患者置换血浆促增殖作用最明显。Westernblot结果显示LN患者置换血浆刺激HMC后p27蛋白水平明显降低，PAI-1蛋白水平显著升高。
⑵LN患者置换血浆刺激HMC后TRIM27表达水平明显增高
Westernblot结果显示，LN患者置换血浆刺激HMC后TRIM27蛋白水平明显增高。免疫荧光结果显示，control组TRIM27主要定位于细胞核，给予LN患者置换血浆刺激后除细胞核外，胞浆中TRIM27阳性信号明显增强。
⑶敲低TRIM27表达能够降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用，减少ECM分泌量
Real-timePCR和westernblot结果显示，与NC组相比，Sh-TRIM27组TRIM27mRNA和蛋白水平均明显降低。
FCM结果显示，与control组相比，LN组S期细胞比例明显增加，G0/G1期细胞比例降低，敲低TRIM27后，S期细胞比例减少，G0/G1期细胞比例升高；EdU掺入结果显示，LN组EdU阳性细胞百分比较control组显著增加，敲低TRIM27后，EdU阳性细胞百分比有所下降；westernblot结果显示，与control组相比，LN组PAI-1蛋白表达水平明显增高，p27表达水平明显降低，敲低TRIM27后，PAI-1蛋白表达水平明显降低，p27降低水平有所恢复；ELISA结果显示，LN组细胞上清中CollagenⅣ蛋白水平较control组明显增加，敲低TRIM27后，其水平明显降低。
⑷FoxO1蛋白在LN患者置换血浆刺激的HMC中失活
给予LN置换血浆刺激后p-FoxO1蛋白表达明显增高，FoxO1蛋白水平明显降低；免疫荧光结果提示，control组FoxO1主要定位于细胞核，给予LN患者置换血浆刺激后FoxO1从胞核转运至胞浆。
⑸TRIM27通过FoxO1参与LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用：westernblot结果表明，与LN+NC组相比，LN+Sh-TRIM27组FoxO1蛋白表达升高，而p-FoxO1蛋白表达降低；IF结果显示，与LN+NC组相比，LN+Sh-TRIM27组FoxO1在细胞浆中表达降低，细胞核中的阳性表达有所恢复。
⑹上调FoxO1表达能够有效降低LN置换血浆对HMC的促增殖作用，减少ECM分泌水平
westernblot结果表明，与LN组相比，LN+WT-FoxO1组FoxO1蛋白水平明显上调。
FCM、EdU掺入、westernblot、ELISA结果显示，过表达FoxO1后，可以降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用，减少ECM分泌量。
⑺抑制TRIM27出核后能够降低LN患者置换血浆引起的HMC增殖和ECM分泌
IF结果显示,给予LN患者置换血浆刺激后除细胞核外，胞浆中TRIM27阳性信号明显增强，LMB预处理后胞浆中TRIM27阳性信号明显减少。
EdU掺入、westernblot、ELISA结果显示，抑制TRIM27出核后，可以降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用，减少ECM分泌量。
结论：
LN患者置换血浆能够上调HMC增殖和ECM分泌水平；敲低TRIM27的表达，可有效抑制LN置换血浆所致的HMC过度增殖和ECM分泌，这种作用通过调节FoxO1蛋白水平实现。
第四部分Akt调节TRIM27/FoxO1信号通路介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和细胞外基质沉积
目的：
本部分研究以体外培养的HMC为研究对象，明确Akt与TRIM27的上下游关系。
方法：
1.HMC接种于6孔板后，5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞，westernblot方法检测Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白表达。
2.HMC随机分为control组、LN组、LN+LY294002组和LN+DMSO组。以20μMLY294002或DMSO孵育1h后，5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞，westernblot方法检测Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308、TRIM27、FoxO1、p27和PAI-1蛋白表达；免疫荧光检测TRIM27定位情况；流式细胞术、EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平，ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
3.HMC随机分为control组、LN组、LN+Sh-TRIM27组和LN+NC组。westernblot方法检测TRIM27、Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白的表达。
结果：
1.LN患者置换血浆能够激活HMC中PI3K/Akt信号通路
Westernblot结果显示，LN患者置换血浆刺激HMC30min后p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平明显增高，Akt蛋白水平未见明显改变。
2.抑制PI3K/Akt信号通路能够通过调节TRIM27介导LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用
Westernblot结果显示，抑制Akt信号通路能够显著减低Akt信号通路活化水平，同时TRIM27蛋白水平明显降低；IF显示，LN组中，TRIM27除胞核外，胞浆中阳性信号明显增强，给予LY294002后TRIM27蛋白在细胞浆中的阳性信号明显减少。
Westernblot、流式细胞术、EdU掺入法和ELISA检测结果显示，抑制Akt信号通路后能够显著降低LN患者置换血浆所诱导的HMC增殖和ECM分泌水平。
3.敲低TRIM27后对PI3K/Akt信号通路的影响
WB结果表明，与control组相比，LN组p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平有所升高，敲低TRIM27后p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平进一步升高；各组中Akt蛋白水平均未见明显改变。
结论：
狼疮性肾炎患者置换血浆可激活HMC中PI3K/Akt信号通路，活化的PI3K/Akt信号通路可能通过调控TRIM27表达和定位改变参与狼疮性肾炎系膜细胞的增殖和细胞外基质沉积。
本研究拟以狼疮性肾炎(lupus nephrits,LN)患者、MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾组织和人系膜细胞(human mesangial cell,HMC)为研究对象，探讨三结构域蛋白27(tripartite motif protein 27, TRIM27)及其相关信号通路在狼疮性肾炎肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)沉积中的作用及其可能机制，为进一步揭示狼疮性肾炎的发病机制，并为探索靶向治疗的方法提供实验依据。具体实验分为以下四部分：
第一部分狼疮性肾炎患者中TRIM27过表达参与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积
目的：
本部分以狼疮患者活检肾脏组织为研究对象，检测TRIM27在肾组织中的表达及定位改变，分析与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积的关系。
方法：
以因肾肿瘤切除的肿瘤远端组织作为对照组，LN肾组织为狼疮性肾炎组，HE和PAS染色观察肾组织形态学改变；免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)检测肾小球TRIM27、PCNA和CollagenⅣ的表达，分析TRIM27与LN细胞增殖和ECM沉积之间的关系。
结果：
HE结果显示，与control组相比，LNⅢ和LNⅣ患者肾小球体积增大，细胞数目明显增多；PAS染色结果显示，基底膜增厚，系膜区增宽，基质明显增多。
IHC结果显示，在control组肾小球中，TRIM27主要定位于肾小球细胞的细胞核中，而在LNⅢ和LNⅣ患者肾小球中，TRIM27则同时表达于肾小球细胞的胞核和胞浆以及系膜增殖区，表达水平明显增强；PCNA和CollagenⅣ在LNⅢ和LNⅣ患者肾小球中表达亦明显增强；且与肾小球中TRIM27表达呈显著正相关。
结论：
LN患者肾小球中TRIM27表达增高并出现定位改变，与肾小球细胞增殖和ECM沉积呈显著正相关。
第二部分MRL/lpr小鼠中TRIM27表达参与肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积
目的：
本部分以MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠为研究对象，检测敲低肾脏TRIM27表达后对肾小球细胞增殖水平和尿蛋白的影响。
方法：
14周龄雌性MRL/lpr小鼠随机分为MRL/lpr组，MRL/lpr+Sh-TRIM27组和MRL/lpr+Sh-NC组，并取同周龄、同性别的MRL/MPJ设为control组，将重组腺相关病毒(Sh-TRIM27-AAV/Sh-NC-AAV)原位注射至小鼠肾脏，10周后留取血、尿标本，处死小鼠收集肾脏组织，免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)、real-timePCR、蛋白印迹技术(western blot, WB)观察转染效率和沉默效果，HE、PAS进行常规病理学观察，IF检测IgG沉积情况，IHC技术检测PCNA、p27、CollagenⅣ、PAI-1蛋白在肾组织中的表达，WB检测PAI-1、p27蛋白的表达，生化分析仪测定血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)、24h尿蛋白等生化指标。
结果：
1.原位注射技术可有效的将Sh-TRIM27-AAV感染至小鼠肾皮质：荧光显微镜下观察冰冻切片，结果表明，原位注射AAV后2周、4周、8周和10周后在小鼠肾皮质均有荧光表达。
2.Sh-TRIM27-AAV有效下调狼疮鼠肾皮质TRIM27mRNA和蛋白表达
Real-timePCR、WB结果显示，与MRL/lpr小鼠相比，MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾组织的TRIM27mRNA和蛋白水平明显降低。
3.敲低TRIM27表达能够降低狼疮鼠肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积水平
HE和PAS结果显示，与control组相比，MRL/lpr组小鼠肾小球体积增大，细胞数目明显增多，基底膜明显增厚，系膜区明显增宽，MRL/lpr+Sh-TRIM27组肾小球体积减小，细胞数目有所减少，基底膜增宽不明显，系膜区增宽水平明显降低；IHC和WB结果显示，与control组相比，MRL/lpr组小鼠细胞处于过度增殖状态，ECM沉积明显增加，敲低TRIM27后抑制了细胞增殖水平，降低了ECM沉积水平。
生化检测结果显示，与control组小鼠相比，MRL/lpr组小鼠24h尿蛋白量明显增加；与MRL/lpr组相比，MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠24h尿蛋白量有所降低，血肌酐和血尿素水平在四组间均无明显差异。
结论：
抑制MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾皮质TRIM27的表达，可有效降低肾小球细胞的增殖和细胞外基质沉积水平，改善小鼠尿蛋白。
第三部分TRIM27通过FoxO1介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和ECM分泌
目的：
本研究以狼疮性肾炎患者、MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾组织和体外培养的HMC为研究对象，检测TRIM27的促增殖作用，并检测相关下游信号通路的活化。
方法：
1.IHC检测对照组和LN患者肾组织中p-FoxO1-Ser256的表达。
2.小鼠随机分为control组，MRL/lpr组，MRL/lpr+Sh-TRIM27组和MRL/lpr+Sh-NC组，IHC检测肾小球FoxO1的表达，WB检测p-FoxO1-Ser256蛋白水平。
3.以HMC为研究对象，给予LN患者置换血浆刺激后，检测TRIM27表达及对HMC增殖和ECM分泌的影响及其作用机制
⑴1%，3%，5%LN患者置换血浆或同比例健康正常人血浆刺激HMC，CCK8方法检测细胞增殖水平，westernblot技术检测p27和PAI-1蛋白水平。
⑵5%健康人或LN患者置换血浆刺激HMC，westernblot方法检测TRIM27蛋白的表达；免疫荧光技术检测TRIM27蛋白定位情况。
⑶HMC随机分为对照组(control)、狼疮性肾炎组(LN)、质粒转染组(LN+Sh-TRIM27)和转染对照组(LN+NC)，细胞融合50%时转染质粒，孵育36h后，加入5%健康人或LN患者置换血浆刺激，12h和48h后分别收集细胞和培养的上清，real-timePCR技术检测TRIM27mRNA的表达，westernblot方法检测TRIM27、p27和PAI-1蛋白的表达。流式细胞术、EdU掺入法检测细胞增殖水平，ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
⑷5%健康人或LN患者置换血浆刺激HMC，westernblot方法检测FoxO1，p-FoxO1-Ser256蛋白水平，免疫荧光技术检测FoxO1蛋白定位情况。
⑸HMC随机分为上述四组，westernblot方法检测FoxO1，p-FoxO1-Ser256蛋白水平，免疫荧光技术检测FoxO1蛋白定位情况。
⑹HMC随机分为对照组(control)，狼疮性肾炎组(LN)，FoxO1转染组(LN+WT-FoxO1)和FoxO1转染对照组(LN+NC)，westernblot方法检测FoxO1、p27和PAI-1蛋白水平，流式细胞术、EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平，ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
⑺细胞随机分为对照组(control)，狼疮性肾炎组(LN)，出核抑制剂组(LN+LMB)，溶剂对照组(LN+ET)，以5nMleptomycinB或无水乙醇预处理12h，5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞后收集细胞，免疫荧光检测TRIM27定位情况；westernblot方法检测FoxO1、p27和PAI-1蛋白表达；EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平，ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
结果：
1.p-FoxO1在狼疮性肾炎患者肾小球中表达明显升高
IHC结果显示，control组肾小球中p-FoxO1蛋白表达较低，狼疮性肾炎患者肾小球中p-FoxO1表达明显增强。
2.MRL/lpr狼疮性肾炎模型小鼠肾皮质中敲低TRIM27表达能够影响FoxO1表达
IHC结果显示，control组小鼠肾小球中，FoxO1蛋白主要定位于细胞核，MRL/lpr小鼠肾小球中FoxO1蛋白表达明显降低，MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾小球中FoxO1蛋白表达有所恢复；westernblot结果表明，与control组小鼠相比，MRL/lpr小鼠肾皮质中p-FoxO1蛋白水平明显增强，MRL/lpr+Sh-TRIM27组小鼠肾皮质中p-FoxO1蛋白水平有所下调。
3.TRIM27通过FoxO1介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和ECM分泌
⑴LN患者置换血浆能够促进HMC增殖
CCK8结果显示，刺激细胞12h后，与含1%、3%和5%健康人血浆刺激组相比，同比例LN患者置换血浆刺激HMC后，细胞增殖水平明显升高，且5%LN患者置换血浆促增殖作用最明显。Westernblot结果显示LN患者置换血浆刺激HMC后p27蛋白水平明显降低，PAI-1蛋白水平显著升高。
⑵LN患者置换血浆刺激HMC后TRIM27表达水平明显增高
Westernblot结果显示，LN患者置换血浆刺激HMC后TRIM27蛋白水平明显增高。免疫荧光结果显示，control组TRIM27主要定位于细胞核，给予LN患者置换血浆刺激后除细胞核外，胞浆中TRIM27阳性信号明显增强。
⑶敲低TRIM27表达能够降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用，减少ECM分泌量
Real-timePCR和westernblot结果显示，与NC组相比，Sh-TRIM27组TRIM27mRNA和蛋白水平均明显降低。
FCM结果显示，与control组相比，LN组S期细胞比例明显增加，G0/G1期细胞比例降低，敲低TRIM27后，S期细胞比例减少，G0/G1期细胞比例升高；EdU掺入结果显示，LN组EdU阳性细胞百分比较control组显著增加，敲低TRIM27后，EdU阳性细胞百分比有所下降；westernblot结果显示，与control组相比，LN组PAI-1蛋白表达水平明显增高，p27表达水平明显降低，敲低TRIM27后，PAI-1蛋白表达水平明显降低，p27降低水平有所恢复；ELISA结果显示，LN组细胞上清中CollagenⅣ蛋白水平较control组明显增加，敲低TRIM27后，其水平明显降低。
⑷FoxO1蛋白在LN患者置换血浆刺激的HMC中失活
给予LN置换血浆刺激后p-FoxO1蛋白表达明显增高，FoxO1蛋白水平明显降低；免疫荧光结果提示，control组FoxO1主要定位于细胞核，给予LN患者置换血浆刺激后FoxO1从胞核转运至胞浆。
⑸TRIM27通过FoxO1参与LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用：westernblot结果表明，与LN+NC组相比，LN+Sh-TRIM27组FoxO1蛋白表达升高，而p-FoxO1蛋白表达降低；IF结果显示，与LN+NC组相比，LN+Sh-TRIM27组FoxO1在细胞浆中表达降低，细胞核中的阳性表达有所恢复。
⑹上调FoxO1表达能够有效降低LN置换血浆对HMC的促增殖作用，减少ECM分泌水平
westernblot结果表明，与LN组相比，LN+WT-FoxO1组FoxO1蛋白水平明显上调。
FCM、EdU掺入、westernblot、ELISA结果显示，过表达FoxO1后，可以降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用，减少ECM分泌量。
⑺抑制TRIM27出核后能够降低LN患者置换血浆引起的HMC增殖和ECM分泌
IF结果显示,给予LN患者置换血浆刺激后除细胞核外，胞浆中TRIM27阳性信号明显增强，LMB预处理后胞浆中TRIM27阳性信号明显减少。
EdU掺入、westernblot、ELISA结果显示，抑制TRIM27出核后，可以降低LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用，减少ECM分泌量。
结论：
LN患者置换血浆能够上调HMC增殖和ECM分泌水平；敲低TRIM27的表达，可有效抑制LN置换血浆所致的HMC过度增殖和ECM分泌，这种作用通过调节FoxO1蛋白水平实现。
第四部分Akt调节TRIM27/FoxO1信号通路介导狼疮性肾炎系膜细胞增殖和细胞外基质沉积
目的：
本部分研究以体外培养的HMC为研究对象，明确Akt与TRIM27的上下游关系。
方法：
1.HMC接种于6孔板后，5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞，westernblot方法检测Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白表达。
2.HMC随机分为control组、LN组、LN+LY294002组和LN+DMSO组。以20μMLY294002或DMSO孵育1h后，5%健康人或LN患者置换血浆刺激细胞，westernblot方法检测Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308、TRIM27、FoxO1、p27和PAI-1蛋白表达；免疫荧光检测TRIM27定位情况；流式细胞术、EdU掺入法免疫荧光技术检测细胞增殖水平，ELISA方法检测细胞上清中CollagenⅣ含量。
3.HMC随机分为control组、LN组、LN+Sh-TRIM27组和LN+NC组。westernblot方法检测TRIM27、Akt、p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白的表达。
结果：
1.LN患者置换血浆能够激活HMC中PI3K/Akt信号通路
Westernblot结果显示，LN患者置换血浆刺激HMC30min后p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平明显增高，Akt蛋白水平未见明显改变。
2.抑制PI3K/Akt信号通路能够通过调节TRIM27介导LN患者置换血浆对HMC的促增殖作用
Westernblot结果显示，抑制Akt信号通路能够显著减低Akt信号通路活化水平，同时TRIM27蛋白水平明显降低；IF显示，LN组中，TRIM27除胞核外，胞浆中阳性信号明显增强，给予LY294002后TRIM27蛋白在细胞浆中的阳性信号明显减少。
Westernblot、流式细胞术、EdU掺入法和ELISA检测结果显示，抑制Akt信号通路后能够显著降低LN患者置换血浆所诱导的HMC增殖和ECM分泌水平。
3.敲低TRIM27后对PI3K/Akt信号通路的影响
WB结果表明，与control组相比，LN组p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平有所升高，敲低TRIM27后p-Akt-Ser473、p-Akt-Thr308蛋白水平进一步升高；各组中Akt蛋白水平均未见明显改变。
结论：
狼疮性肾炎患者置换血浆可激活HMC中PI3K/Akt信号通路，活化的PI3K/Akt信号通路可能通过调控TRIM27表达和定位改变参与狼疮性肾炎系膜细胞的增殖和细胞外基质沉积。