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多药耐药（Multidrug resistance,MDR）是一种严重的肿瘤细胞耐药现象，是化疗失败的重要原因。P-糖蛋白（P-Glycoprotein,P-gp）为最早被发现的ABC转运蛋白，肿瘤细胞P-gp过表达是发生MDR的常见机制之一，会导致临床化疗的失败。抗癌药物与P-gp抑制剂的联合使用可提高肿瘤细胞当中化疗药物的累积，从而提高化疗药物的治疗效果，实现逆转MDR。目前P-gp抑制剂已开发至第三代，因严重毒副作用而止步于临床前或临床研究。因此，开发高选择性、低毒副作用的P-gp抑制剂，对逆转肿瘤治疗中P-gp所介导的MDR具有重大意义。中药（Traditional Chinese Medicine,TCM）具有化学结构新颖，毒性较小等优点，是P-gp抑制剂筛选重要来源。目前小分子与P-gp之间的相互作用研究主要停留于细胞层面，实验手段耗时费力，且准确性有限，缺少精确快速的筛选方法。另外，对于P-gp抑制剂的评价还停留在体外阶段，体内研究相对较少。
针对P-gp抑制剂筛选所面临的问题，本论文以P-gp为研究核心，运用多种膜蛋白稳定策略，获得构象正确且活性良好的P-gp蛋白，结合表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）技术专属性高及快速等优点，建立P-gp抑制剂高效筛选新方法以及从体外到体内的潜在抑制剂与P-gp相互作用评价体系。
本课题研究内容主要分为以下三个部分：
1、基于慢病毒载体膜蛋白稳定策略结合SPR的中药P-gp潜在抑制剂筛选方法的建立
将慢病毒（Lentiviral particles,LVP）稳定膜蛋白策略与SPR技术相结合，构建P-gp特异性配体筛选系统，从TCM中筛选P-gp潜在抑制剂，进行体外验证其生物学活性。首先，构建了不同P-gp表达水平的慢病毒颗粒，并鉴定了慢病毒上P-gp的表达。然后，将P-gp高低表达的慢病毒颗粒固定在CM5芯片的不同通道上进行亲和力检测。测定了阳性药Valspodar和环孢素（Cyclosporine A,CsA）与芯片上P-gp之间结合的KD值分别为14.09μM和16.41μM。采用此筛选系统从40种中药单体中筛选出3个化合物为潜在的P-gp配体。亲和力实验表明，厚朴酚、和厚朴酚、白藜芦醇与芯片上P-gp结合的KD值分别为15.88，6.44和70.01μM。随后进行体外验证实验，罗丹明123（Rhodamine123,Rh123）双向转运实验表明，这3个化合物均能抑制Rh123的外排。此外，和厚朴酚和白藜芦醇可将Adr对MCF-7/ADR细胞的IC50值由17.54±4.54μg/mL分别降低至9.56±0.60μg/mL和8.00±1.60μg/mL，表明这两种化合物具有逆转MCF-7/ADR细胞MDR的活性。蛋白印迹（Western blot，WB）和流式细胞仪分析结果表明，厚朴酚与和厚朴酚均能下调耐药癌细胞中P-gp的表达水平。本实验基于慢病毒膜蛋白稳定技术结合SPR生物传感器构建了一种新型P-gp配体筛选系统，以慢病毒作为P-gp的载体，可保持其天然构象，方法专属性较强，用于体外研究小分子与P-gp的相互作用。相较于传统细胞实验筛选，大大缩短了实验时间。
2、SMA聚合物萃取细胞膜蛋白策略结合SPR建立P-gp潜在抑制剂快速筛选新方法研究
应用苯乙烯马来酸聚合物（Styrene-co-maleic acid,SMA）膜蛋白稳定策略，将P-gp固定在其内源性的脂质环境当中，结合SPR技术建立快速筛选P-gp潜在抑制剂方法。首先，以正常乳腺癌细胞MCF-7和耐阿霉素（Adriamycin,Adr）的乳腺癌细胞MCF-7/ADR为模型，采用SMA聚合物技术从细胞膜当中萃取出膜蛋白，获得相应的蛋白脂质体（SMA lipid particles,SMALPs）。同时对SMA聚合物萃取膜蛋白前处理方法进行了优化，并对筛选系统进行方法学考察，包括脂质体稳定性、芯片饱和性、芯片特异性及SMA聚合物对筛选结果的干扰。实验结果表明，SMA聚合物前处理最佳条件为细胞膜超声破碎20s，反应时间4h，膜浓度为40mg/mL，阳性药Valspodar与芯片结合KD值为26.12μM，表明芯片具有良好特异性。芯片中脂质体稳定性为24h，且样品中残留的SMA聚合物对测试结果无干扰。将SMALPs偶联至L1芯片的不同通道上进行亲和力检测，由此构建P-gp潜在抑制剂筛选体系（P-gp-SMALP-SPR）。应用此筛选系统从50种中药单体中筛选出9个单体成分作为目标化合物，并对它们进行体外生物活性验证。结果发现粉防己碱、防己诺林碱、白花前胡乙素、黄芩新素和淫羊藿素可以显著降低Adr对MCF-7/ADR细胞的IC50值。其中粉防己碱，白花前胡乙素和黄芩新素可通过抑制P-gp的功能逆转P-gp所介导的多药耐药。本实验所建立的筛选系统专属性较强，可实现快速筛选P-gp潜在抑制剂，大大缩短了筛选时间，筛选得到的白花前胡乙素和黄芩新素均为首次报道具有逆转MDR活性。
3、P-gp潜在抑制剂逆转肿瘤多药耐药活性的体内评价-以粉防己碱为例
目前P-gp潜在抑制剂体内研究较少，体内药效、药物相互作用以及毒理学特性数据缺乏。粉防己碱（Tetrandrine,TET）是由P-gp-SMALP-SPR筛选系统得到的P-gp潜在抑制剂，细胞活性实验证实，TET可将Adr对MCF-7/ADR细胞的IC50值由86.09±4.74μM降至13.52±0.63μM，在筛选得到的9个小分子中，体外逆转MDR活性最高。在体内对TET逆转MDR活性进行评价，采用MCF-7/ADR细胞构建小鼠移植瘤模型，应用联合给药方式，通过瘤体重量与体积比较P-gp潜在抑制剂TET联合紫杉醇（Paclitaxel,PTX）治疗MCF-7/ADR移植瘤的效果，得到PTX单独给药对肿瘤小鼠的抑瘤率为42.34%，TET单独给药组抑瘤率为61.03%，PTX和TET联合用药抑瘤率为82.44%，是单独给抗癌药PTX的2倍。建立LC-MS/MS法对血浆及肿瘤组织中的PTX进行测定，比较TET对PTX在小鼠血浆及肿瘤中分布的影响，从而对TET逆转P-gp介导的肿瘤MDR进行综合评价。结果显示血浆和肿瘤组织LC-MS/MS方法专属性良好，日内和日间精密度RSD值均小于15%，基质效应RSD值小于15%，基质对PTX的测定无影响。TET联合PTX给药后，肿瘤当中PTX的累积量由17.51±8.46（ng/g）增加至141.75±70.15（ng/g），表明TET可提高PTX对耐药人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制效果，同时TET联合用药不会提高抗癌药PTX在血浆当中的浓度。通过小动物活体成像对瘤体中PTX的分布进行监测，结果均表明TET增加了PTX在耐药肿瘤中的累积和分布。本实验从瘤体大小与重量、PTX的血药浓度以及PTX在肿瘤组织当中的累积量和分布的改变三个层面建立了P-gp潜在抑制剂逆转肿瘤MDR活性的体内评价体系。
针对P-gp抑制剂筛选所面临的问题，本论文以P-gp为研究核心，运用多种膜蛋白稳定策略，获得构象正确且活性良好的P-gp蛋白，结合表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）技术专属性高及快速等优点，建立P-gp抑制剂高效筛选新方法以及从体外到体内的潜在抑制剂与P-gp相互作用评价体系。
本课题研究内容主要分为以下三个部分：
1、基于慢病毒载体膜蛋白稳定策略结合SPR的中药P-gp潜在抑制剂筛选方法的建立
将慢病毒（Lentiviral particles,LVP）稳定膜蛋白策略与SPR技术相结合，构建P-gp特异性配体筛选系统，从TCM中筛选P-gp潜在抑制剂，进行体外验证其生物学活性。首先，构建了不同P-gp表达水平的慢病毒颗粒，并鉴定了慢病毒上P-gp的表达。然后，将P-gp高低表达的慢病毒颗粒固定在CM5芯片的不同通道上进行亲和力检测。测定了阳性药Valspodar和环孢素（Cyclosporine A,CsA）与芯片上P-gp之间结合的KD值分别为14.09μM和16.41μM。采用此筛选系统从40种中药单体中筛选出3个化合物为潜在的P-gp配体。亲和力实验表明，厚朴酚、和厚朴酚、白藜芦醇与芯片上P-gp结合的KD值分别为15.88，6.44和70.01μM。随后进行体外验证实验，罗丹明123（Rhodamine123,Rh123）双向转运实验表明，这3个化合物均能抑制Rh123的外排。此外，和厚朴酚和白藜芦醇可将Adr对MCF-7/ADR细胞的IC50值由17.54±4.54μg/mL分别降低至9.56±0.60μg/mL和8.00±1.60μg/mL，表明这两种化合物具有逆转MCF-7/ADR细胞MDR的活性。蛋白印迹（Western blot，WB）和流式细胞仪分析结果表明，厚朴酚与和厚朴酚均能下调耐药癌细胞中P-gp的表达水平。本实验基于慢病毒膜蛋白稳定技术结合SPR生物传感器构建了一种新型P-gp配体筛选系统，以慢病毒作为P-gp的载体，可保持其天然构象，方法专属性较强，用于体外研究小分子与P-gp的相互作用。相较于传统细胞实验筛选，大大缩短了实验时间。
2、SMA聚合物萃取细胞膜蛋白策略结合SPR建立P-gp潜在抑制剂快速筛选新方法研究
应用苯乙烯马来酸聚合物（Styrene-co-maleic acid,SMA）膜蛋白稳定策略，将P-gp固定在其内源性的脂质环境当中，结合SPR技术建立快速筛选P-gp潜在抑制剂方法。首先，以正常乳腺癌细胞MCF-7和耐阿霉素（Adriamycin,Adr）的乳腺癌细胞MCF-7/ADR为模型，采用SMA聚合物技术从细胞膜当中萃取出膜蛋白，获得相应的蛋白脂质体（SMA lipid particles,SMALPs）。同时对SMA聚合物萃取膜蛋白前处理方法进行了优化，并对筛选系统进行方法学考察，包括脂质体稳定性、芯片饱和性、芯片特异性及SMA聚合物对筛选结果的干扰。实验结果表明，SMA聚合物前处理最佳条件为细胞膜超声破碎20s，反应时间4h，膜浓度为40mg/mL，阳性药Valspodar与芯片结合KD值为26.12μM，表明芯片具有良好特异性。芯片中脂质体稳定性为24h，且样品中残留的SMA聚合物对测试结果无干扰。将SMALPs偶联至L1芯片的不同通道上进行亲和力检测，由此构建P-gp潜在抑制剂筛选体系（P-gp-SMALP-SPR）。应用此筛选系统从50种中药单体中筛选出9个单体成分作为目标化合物，并对它们进行体外生物活性验证。结果发现粉防己碱、防己诺林碱、白花前胡乙素、黄芩新素和淫羊藿素可以显著降低Adr对MCF-7/ADR细胞的IC50值。其中粉防己碱，白花前胡乙素和黄芩新素可通过抑制P-gp的功能逆转P-gp所介导的多药耐药。本实验所建立的筛选系统专属性较强，可实现快速筛选P-gp潜在抑制剂，大大缩短了筛选时间，筛选得到的白花前胡乙素和黄芩新素均为首次报道具有逆转MDR活性。
3、P-gp潜在抑制剂逆转肿瘤多药耐药活性的体内评价-以粉防己碱为例
目前P-gp潜在抑制剂体内研究较少，体内药效、药物相互作用以及毒理学特性数据缺乏。粉防己碱（Tetrandrine,TET）是由P-gp-SMALP-SPR筛选系统得到的P-gp潜在抑制剂，细胞活性实验证实，TET可将Adr对MCF-7/ADR细胞的IC50值由86.09±4.74μM降至13.52±0.63μM，在筛选得到的9个小分子中，体外逆转MDR活性最高。在体内对TET逆转MDR活性进行评价，采用MCF-7/ADR细胞构建小鼠移植瘤模型，应用联合给药方式，通过瘤体重量与体积比较P-gp潜在抑制剂TET联合紫杉醇（Paclitaxel,PTX）治疗MCF-7/ADR移植瘤的效果，得到PTX单独给药对肿瘤小鼠的抑瘤率为42.34%，TET单独给药组抑瘤率为61.03%，PTX和TET联合用药抑瘤率为82.44%，是单独给抗癌药PTX的2倍。建立LC-MS/MS法对血浆及肿瘤组织中的PTX进行测定，比较TET对PTX在小鼠血浆及肿瘤中分布的影响，从而对TET逆转P-gp介导的肿瘤MDR进行综合评价。结果显示血浆和肿瘤组织LC-MS/MS方法专属性良好，日内和日间精密度RSD值均小于15%，基质效应RSD值小于15%，基质对PTX的测定无影响。TET联合PTX给药后，肿瘤当中PTX的累积量由17.51±8.46（ng/g）增加至141.75±70.15（ng/g），表明TET可提高PTX对耐药人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制效果，同时TET联合用药不会提高抗癌药PTX在血浆当中的浓度。通过小动物活体成像对瘤体中PTX的分布进行监测，结果均表明TET增加了PTX在耐药肿瘤中的累积和分布。本实验从瘤体大小与重量、PTX的血药浓度以及PTX在肿瘤组织当中的累积量和分布的改变三个层面建立了P-gp潜在抑制剂逆转肿瘤MDR活性的体内评价体系。