心脑血管疾病是一类由于心脏或血管病变导致的循环系统功能紊乱的疾病的统称,是世界范围内尤其是亚洲地区的首要死亡原因,对人类的生命健康构成了严重威胁。在中国,每年死于心脑血管疾病约有300万人,为死亡人口总数的41%左右。因此对心脑血管疾病的预防和治疗是药物研发领域的迫切任务。由于心脑血管系统的复杂性,其致病因素颇为繁杂,而血栓形成在心脑血管疾病的发病机制中起到关键作用；与血栓栓塞密切相关的血小板聚集和氧化应激也是心脑血管疾病发病的两种始动因素。迄今为止,临床上用于预防和治疗血栓的抗凝血剂主要有两种类型：肝素类及维生素K拮抗剂,然而这些药物存在给药不方便、起效慢、治疗窗窄、复杂的药物相互作用等诸多局限性。因此,研究和开发高效低毒、高选择性的新型抗凝血药物就成为心脑血管药物研发的热点。本论文的研究内容分为两大部分：第一部分为新型凝血因子Xa (FXa)抑制剂的设计、合成与抗凝血及FXa抑制活性的研究；第二部分为新型川芎酸酚酯类衍生物的设计、合成与抗血小板聚集及抗内皮细胞氧化损伤生物活性评价。1.新型FXa抑制剂的设计、合成与抗凝血活性和FXa抑制活性的研究FXa位于人体内、外两条凝血途径的交汇点,抑制FXa能够同时切断两条凝血途径,因此FXa已经成为抗凝血药物研发的一个有吸引力的靶点。目前已经有三种FXa抑制剂：利伐沙班(rivaroxaban)、阿哌沙班(apixaban)和依度沙班(edoxaban)在美国、欧洲和日本上市。以利伐沙班为活性先导化合物,通过分析“利伐沙班-FXa复合体”的晶体结构,发现FXa中存在S1、S4两个结合口袋,两口袋之间存在一定的夹角；利伐沙班分子也可分为三部分：P1区、P4区和两者之间的linker。FXa的S1口袋为较小的疏水口袋,容纳利伐沙班的P1区5-氯噻吩；S4口袋为大的疏水口袋,与利伐沙班的P4区苯环形成π-π堆积作用；两口袋之间的Gly219与利伐沙班的linker形成两个氢键。根据先导化合物与FXa的结合模式,对先导化合物的P4区、linker进行结构改造,通过变换linker的角度和P4区的体积、疏水性等,设计了双酰基哌嗪类FXa抑制剂和氨基苄胺类FXa抑制剂,以期得到活性改善的新型FXa抑制剂。为验证设计思想的合理性,用计算机辅助药物设计软件对所设计的化合物进行了对接分析和虚拟筛选,分析结果表明目标分子的结构修饰具有理论上的合理性。对设计的化合物进行了定向合成,通过成环反应、重氮化反应、酰化反应等实验步骤,共合成了两个系列40个FXa抑制剂。所合成的双酰基哌嗪类FXa抑制剂和氨基苄胺类FXa抑制剂的结构经光谱确证。对所合成的FXa抑制剂进行了抗凝血试验。以利伐沙班作为对照药,用STAGO凝血酶原时间试剂盒,与凝血酶原时间测定仪中测定化合物对贫血小板血浆的凝血酶原时间的影响,以“致凝血时间加倍浓度”(PTCT2, clotting time doubling concentration for prothrombin time)评价化合物抗凝血活性。其中部分化合物表现出良好的抗凝血活性,化合物H10, H13, H14, H17, PTCT2值分别为1.3,3.1,2.7,1.0μM,其中化合物H17抗凝血活性优于先导化合物利伐沙班(PTCT2=1.3μM)。与此同时,对化合物的FXa抑制活性进行了测定。FXa可以催化发色底物S-2222生成对硝基苯胺,在405nm下有紫外吸收峰。以利伐沙班作为对照药,通过酶标仪测定FXa抑制剂对405nm下吸光度的影响,得到化合物对FXa的抑制活性IC50值。活性结果显示部分化合物显示出良好活性。其中化合物H17对FXa的抑制活性(IC50=1.9μM)略高于阳性对照药利伐沙班(IC50=3.3μM)。总之,通过合理药物设计和虚拟筛选设计了两个系列的FXa抑制剂,并通过定向合成得到40个化合物,通过活性测定发现了活性先导化合物,为进一步研究开发奠定了基础。2.新型川芎酸酚酯类衍生物的设计、合成与抗血小板和抗内皮细胞氧化损伤生物活性评价川芎嗪是川芎的主要活性物质之一。药理学研究证明,川芎嗪表现出多种心脑血管药理活性,如清除自由基、抗血小板聚集与血栓形成、保护内皮细胞等。然而,川芎嗪药理活性不强、体内代谢快、生物利用度低,因此对其进行结构改造,改善其药效学和药代动力学性质,以研发高效抗心脑血管疾病药物有重要的意义。本课题组对川芎嗪进行了长期、大量的结构改造工作,对川芎嗪衍生物的结构改造和构效关系有深入的认识。川芎嗪的代谢产物3,5,6三甲基吡嗪甲酸的药理活性研究表明其具有抗凝血活性和降低血浆低密度脂蛋白水平等作用。川芎所含的另一种活性成分肉桂酸类化合物具有较好的抗氧化、清除自由基的作用。肉桂酸衍生物奥扎格雷(ozagrel)是选择性的血栓烷A2合成酶抑制剂,具有抗血小板聚集活性。依据药物化学中的拼合原理,将3,5,6三甲基吡嗪甲酸的结构和肉桂酸的结构拼合,设计了一系列新型川芎酸酚酯类衍生物。对所合成川芎酸酚酯类衍生物进行了体外抗血小板聚集活性测定保护过氧化损伤的血管内皮细胞的活性试验。以奥扎格雷和氯吡格雷作为阳性对照药,用微量反应板酶标仪比浊法测定所合成的化合物对血小板聚集率的影响。活性实验结果表明：川芎酸酚酯类衍生物F’1, F2, F3, F5, F’7和F’9表现出良好的活性(IC50分别为24.4,26.4,9.6,41.8,28.2和37.5μM),均超过了阳性对照药奥扎格雷(IC50=144.1μM),尤其是化合物F3活性最为显著,为阳性对照药奥扎格雷活性的15倍以上,接近氯毗格雷活性(IC50=7.6pM)。以MTT比色法对所合成的川芎酸酚酯类衍生物进行了保护血管内皮细胞过氧化损伤活性试验,以药物硫辛酸和常用抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)为阳性对照。活性试验数据显示：化合物F2,F5,F’5,F’9,F10,F’10表现出了较好的内皮细胞保护作用(EC50分别为24.0,8.8,29.9,21.4,2.2和1.7μM)。尤其是化合物F’10,活性远高于阳性对照药硫辛酸和BHA(EC50分别为68.0和111.4μM)。综上所述,依据拼合原理设计了一系列川芎酸酚酯类衍生物(20个),并对合成的川芎嗪衍生物进行了抗血小板聚集活性和血管内皮细胞保护活性的测定,发现其中一些化合物具有良好的活性,具有进一步研究的价值。