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目的:动物去势术仍是畜牧生产中一个急需解决的问题。因为传统的手术去势往往遗留后遗症,且在施术过程中对人畜的安全构成威协等,而免疫去势法可以克服传统方法的不足。本研究系统地研究了免疫去势疫苗MBP-GnRH-I6的制备、效果以及免疫去势的机理,旨在研制出一种免疫原性强且成本低的免疫去势疫苗并阐明其去势的机制。方法:(1)将人工合成的GnRH-I六聚体基因插入麦芽糖结合蛋白融合表达系统载体pMAL-c4x中,重组质粒转化到大肠杆菌(E.coli TB1)中并用IPTG进行诱导表达,多糖树脂(amylose resin)亲和层析法纯化蛋白。应用SDS-PAGE、HPLC法对纯化蛋白进行分析。Western blot鉴定融合蛋白的反应原性。(2)同龄健康的杜洛克×长白×大白初生公猪,随机平均分为3组,分别为免疫组,阳性对照组(不去势组)和阴性对照组(手术阉割组)。用PBS溶解MBP-GnRH-I6,并与AL(OH)3佐剂充分乳化。免疫组猪颈部肌肉注射2mL的乳化剂(含1mg MBP-GnRH-I6),采用同样的剂量与路线加强免疫一次。实验期间从前腔静脉采血置于4℃过夜,然后4℃2000g离心20min,收集血清-80℃保存。游标卡尺测量阴囊直径,酶联免疫分析法测血清GnRH-I抗体效价,放射免疫分析法测血清睾酮浓度,屠宰时取睾丸,称重并测量大小,取睾丸组织用福尔马林固定,制做5μm厚的切片,HE染色后观察其组织学变化,随机选取每头猪的5张睾丸组织切片,用形态学分析软件统计生精小管中不同发育阶段的生殖细胞数目,探明MBP-GnRH-I6的免疫去势效果。(3)屠宰后,迅速取出下丘脑、腺垂体和睾丸,置于液氮中,-80℃保存。采用实时荧光定量PCR法,分析下丘脑GnRH-I和GnRH-IR mRNA,垂体中GnRH-IR,FSHβ和LHβmRNA以及睾丸中GnRH-IR、FSH受体、LH受体、3βHSD和17βHSD mRNA的变化。透射电镜观察垂体促性腺激素细胞,睾丸生精细胞、支持细胞和间质细胞的超微结构,探讨MBP-GnRH-I6主动免疫对生殖轴上相关生殖激素及其受体的影响以及垂体和睾丸组织超微结构的变化。(4)免疫前和屠宰时称猪体重,酶联免疫分析法检测血清猪生长激素,放射免疫分析法检测血清IGF-I水平,Pearson相关分析血清睾酮与IGF-I的相关性,探讨免疫去势猪生长快的初步机理。(5)HPLC法分析背膘脂肪中雄烯酮和3-甲基吲哚的含量,探明MBP-GnRH-I6主动免疫对公猪肉膻味的影响。结果:(1)与麦芽糖结合蛋白基因融合的GnRH-I六聚体基因在E.coli TB1中能够高效表达,且为可溶性表达,经多糖树脂亲和层析纯化后,获得高纯度的MBP-GnRH-I6融合蛋白(纯度达97.68%),其分子量大小与理论值(50kDa)一致,且Western blot表明MBP-GnRH-I6融合蛋白与GnRH-I抗体发生特异性反应。(2)MBP-GnRH-I6主动免疫能诱导公猪产生高效的抗GnRH-I抗体,导致血清睾酮浓度显著下降(P<0.05),阴囊直径增大缓慢且比阳性对照组短(P<0.05),屠宰时睾丸的纵径、横径、纵周长、横周长和重量均小于阳性对照组(P<0.05),睾丸组织切片显示,生精小管严重发育不良,精原细胞、初级精母细胞和精子细胞退化且没有精子,管壁不同发育阶段的生精细胞数目明显减少(P<0.01)。(3)免疫组,阳性对照组和阴性对照组公猪下丘脑GnRH-IR和GnRH-I mRNA表达差异不显著(P>0.05),垂体中FSHβmRNA、LHβmRNA显著地低于阴、阳对照组(P<0.05),GnRH-IR mRNA显著地低于阴性对照组和阳性对照组(P<0.05)。免疫组公猪睾丸FSH受体、LH受体mRNA表达均显著地低于阳性对照组(P<0.05),但3βHSD和17βHSD mRNA却高于阳性对照组(P<0.05)。超微结构显示,免疫猪垂体促性腺激素细胞颗粒减少,睾丸生精小管基膜增生,初级精母细胞线粒体数量明显减少,精子细胞核内染色质聚集成块状,分布于核膜四周,细胞器少,支持细胞线粒体少数空泡变性,线粒体嵴断裂。间质细胞少数线粒体空泡变性,胞浆内溶酶体增多。(4)MBP-GnRH-I6主动免疫猪体重显著重于阴性对照组(P<0.05),但不影响公猪血清pGH水平(P>0.05)。在17～21周龄时,免疫组公猪血清IGF-I浓度显著低于阳性对照组(P<0.05),21～25周龄时免疫组公猪血清IGF-I显著高于阴性对照组(P<0.05)。相关分析表明血清睾酮与IGF-I呈正相关。(5)免疫组背膘脂肪雄烯酮下降,和阴性对照组一样低于检测下限;但是免疫组、阳性对照组和阴性对照组公猪3-甲基吲哚水平差异不显著(P>0.05)。结论:(1)成功构建出GnRH-I6基因工程体,获得高纯度且具有良好反应原性的MBP-GnRH-I6。(2)MBP-GnRH-I6主动免疫使公猪血清睾酮浓度维持在较低的水平,睾丸显著萎缩,表明是成功的免疫去势。(3)MBP-GnRH-I6主动免疫降低公猪垂体FSHβmRNA、LHβmRNA和GnRH-IR mRNA以及睾丸FSH受体、LH受体、3βHSD和17βHSD mRNA的表达,损伤了垂体促性腺激素细胞及睾丸组织的支持细胞、间质细胞和生精细胞的超微结构。揭示MBP-GnRH-I6主动免疫可能通过降调生殖轴生殖激素及其受体mRNA数量,以及破坏生殖轴细胞的亚显微结构影响公猪生殖机能。(4)MBP-GnRH-I6主动免疫改变了公猪生长性能,增加体重,其作用途径可能是睾酮通过调控血清IGF-I水平来调控的。(5)MBP-GnRH-I6主动免疫降低脂肪雄烯酮含量,消除膻味,改善了肉质。