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目的:缺血性疾病,如缺血性脑卒中、缺血性心肌病、股骨头缺血性坏死、缺血性肠病等,是临床上一类严重危害人民群众健康的疾病。随着近年来社会和经济的不断发展人们膳食结构的改变,高糖高脂饮食,生活工作压力增加,社会人口老年化等原因,导致该类疾病的发病率逐年上升并且趋向年轻化,已成为困扰公众的社会问题。由于该类疾病致病过程慢性进行性、发病突然、致死致残率高,不但严重影响了患者生活质量,使其饱受痛苦,还给其家庭、社会及国家带来了沉重负担。目前临床上通过采用药物溶栓或抗凝、血管搭桥、介入手术等方式治疗,在一定程度上可以改善患者的症状,但如果血管呈弥漫性病变或病变发生在直径小于2mm的小血管,则无法取得满意疗效,而且手术存在再灌注损伤、危险性大、并发症多、费用昂贵、术后再狭窄等缺点。因此,探索一个有效、简便、可行的治疗方法是当前迫切需要解决的问题。1993年,由Hockel等最早提出的应用治疗性血管新生疗法,通过刺激局部血管的再生和损伤组织的再建达到治疗目的,是目前缺血性疾病治疗、创伤修复等领域备受瞩目的研究重点[1]。前期我们发现HGF有促进烧伤创面愈合,修复创伤部位[2];对犬下肢静脉缺血模型的血管及肌肉等组织具有保护作用[3,4];同时可以上调Notch1及Dll4的mRNA水平[5]。基于此,本研究以hUCMSCs为体外研究细胞模型,以前期课题组合成的重组腺病毒Ad-HGF为研究对象,系统分析Ad-HGF通过Notch1/Dll4信号通路的调控作用对hUCMSCs增殖能力、细胞周期、细胞毛细管腔状结构形成、迁移能力等功能的影响;Notch1/Dll4信号通路及血管动静脉标志物转录水平及蛋白表达水平的变化。最终阐明HGF与hUCMSCs信号通路的关系及机制,揭示Ad-HGF促进动静脉血管分化的作用,具有重要的理论意义和应用价值。一、人脐带间充质干细胞的分离培养、鉴定及诱导分化。方法:取正常足月生产新生儿脐带,采取组织贴壁法分离原代hUCMSCs,观察细胞生长形态。采取流式细胞仪技术检测hUCMSCs细胞表型及细胞周期。通过成神经细胞诱导和成脂肪细胞诱导鉴定hUCMSCs的诱导分化能力。结果:成功分离和培养hUCMSCs原代细胞。细胞经流式细胞仪鉴定高表达间质细胞标志CD44(96.73%)和CD105(96.10%),整合素受体CD29(99.53%);低表达造血系标志CD34(0.8%)和CD45(1.91%),人白细胞抗原HLA-DR(1.41%),符合hUCMSCs细胞表型特征。细胞周期检测大部分hUCMSCs处于G0/G1期。hUCMSCs成神经细胞诱导,出现神经元样细胞,Nestin蛋白免疫组化检测阳性。hUCMSCs成脂肪细胞诱导,出现空泡样脂滴,油红O染色检测阳性。结论:成功分离及培养了具有多向分化潜能的hUCMSCs,可以用于后续实验的研究。二、人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定。方法:根据Gene Bank中Notch1基因mRNA序列(NM017617)设计合成shRNA序列,并且连接到pGenesil-1.1质粒上,酶切及测序鉴定。通过体外同源重组将Notch1-shRNA表达框转移至腺病毒表达载体pGsadeno上,酶切线性化后脂质体转染包装细胞HEK293,制备获得重组腺病毒。腺病毒转染hUCMSCs,观察细胞形态及GFP蛋白的表达,提取总RNA和总蛋白,RT-PCR及Western Blot检测细胞Notch1的转录及蛋白表达水平。结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确。转染hUCMSCs后,RT-PCR及Western Blot检测,可显著抑制细胞Notch1的基因转录及蛋白表达,对基因转录沉默效率约为68.04%(P<0.05);对蛋白表达默效率约为80.32%(P<0.05)。结论:成功构建了重组腺病毒rAd5-Notch1-shRNA,能高效转染hUCMSCs细胞,具有Notch1基因沉默效应。三、Ad-HGF诱导hUCMSCs向血管动静脉内皮细胞分化的体外研究。方法:以hUCMSCs为研究对象,实验分为五组:腺病毒Ad-GFP组、Ad-GFP-Notch1-shRNA组(简称为Ad-shRNA组)、Ad-GFP-NICD组(简称为Ad-NICD组)、Ad-HGF组和空白对照组。首先通过MTT实验检测各组细胞生存率,判定各组腺病毒的最佳感染MOI。显微镜下观察各组细胞形态。ELISA实验检测Ad-HGF组细胞培养上清中HGF的表达水平。MTT法测定OD490nm值,绘制细胞生长曲线。流式细胞仪检测各组细胞周期情况。随后分别检测各组细胞贴壁能力、迁移能力及体外成血管能力。实时定量荧光PCR法检测Notch信号通路中:Notch1、Dll4及Hey-2基因;静脉标志物EphB4基因;动脉标志物ephrin B2基因的转录水平。最后WesternBolt检测Notch1、EphB4及ephrin B2蛋白的表达。结果:Ad-GFP组最佳MOI为100倍;Ad-NICD组、Ad-shRNA组及Ad-HGF组最佳MOI为50倍。转染后镜下观察,除Ad-HGF组外,其他各组,均出现GFP的表达;Ad-NICD组,细胞增殖速度快,形成多个不完整的管腔样结构;Ad-HGF组,细胞分散生长,早期增殖速度较快,随后出现了大量的分泌小泡。ELISA检测Ad-HGF组培养48h后,上清中HGF的表达与对照组相比显著增多(P<0.05),96h达到峰值562.97±27.09pg/mL。Ad-NICD组和Ad-HGF组能显著促进细胞增殖,在48、72、96h时具有显著差异(P<0.05);Ad-shRNA组能抑制细胞增殖,在72h时具有显著差异(P<0.05)。流式细胞仪检测,Ad-NICD组细胞S期比例有较大增高(36.02%),细胞DNA复制活跃,具有较强增殖活性。细胞贴壁实验中,Ad-HGF组在12、16、20h及Ad-NICD组在20h细胞贴壁率大于对照组(P<0.05);Ad-shRNA组在8、12、16h细胞贴壁率小于对照组(P<0.05)。Transwell小室实验发现Ad-HGF组及Ad-NICD组能促进细胞迁移,而Ad-shRNA组抑制细胞迁移(P<0.05)。体外成血管实验,Ad-NICD组和Ad-HGF组出现了明显的管状结构,其余各组未见。实时定量荧光PCR检测,Ad-HGF组及Ad-NICD组的Notch1、Dll4、Hey-2基因转录水平高于其余各组(P<0.05),而Ad-shRNA组则低于其余各组(P<0.05),Ad-GFP组与空白对照组之间、Ad-HGF组与Ad-NICD组之间无统计学差异(P>0.05)。静脉标志物EphB4基因,Ad-GFP组、Ad-HGF组及Ad-shRNA组与空白对照组相比较,无统计学差异(P>0.05),而Ad-NICD组基因转录水平高于空白对照组(P<0.05)。动脉标志物ephrin B2基因,Ad-GFP组、Ad-shRNA组和空白对照组之间、Ad-HGF组与Ad-NICD组之间,无统计学差异(P>0.05),Ad-HGF组和Ad-NICD组细胞的ephrin B2基因转录水平高于其余各组(P<0.05)。Western Blot检测,Ad-HGF组与Ad-NICD组高表达Notch1蛋白和ephrin B2蛋白,Ad-shRNA组低表达Notch1蛋白和ephrin B2蛋白,具有统计学差异(P<0.05)。结论:HGF能通过激活Notch1/Dll4信号通路诱导hUCMSCs向动脉血管分化。