论文部分内容阅读
目的：缺血性疾病，如缺血性脑卒中、缺血性心肌病、股骨头缺血性坏死、缺血性肠病等，是临床上一类严重危害人民群众健康的疾病。随着近年来社会和经济的不断发展人们膳食结构的改变，高糖高脂饮食，生活工作压力增加，社会人口老年化等原因，导致该类疾病的发病率逐年上升并且趋向年轻化，已成为困扰公众的社会问题。由于该类疾病致病过程慢性进行性、发病突然、致死致残率高，不但严重影响了患者生活质量，使其饱受痛苦，还给其家庭、社会及国家带来了沉重负担。目前临床上通过采用药物溶栓或抗凝、血管搭桥、介入手术等方式治疗，在一定程度上可以改善患者的症状，但如果血管呈弥漫性病变或病变发生在直径小于2mm的小血管，则无法取得满意疗效，而且手术存在再灌注损伤、危险性大、并发症多、费用昂贵、术后再狭窄等缺点。因此，探索一个有效、简便、可行的治疗方法是当前迫切需要解决的问题。1993年，由Hockel等最早提出的应用治疗性血管新生疗法，通过刺激局部血管的再生和损伤组织的再建达到治疗目的，是目前缺血性疾病治疗、创伤修复等领域备受瞩目的研究重点[1]。前期我们发现HGF有促进烧伤创面愈合，修复创伤部位[2]；对犬下肢静脉缺血模型的血管及肌肉等组织具有保护作用[3,4]；同时可以上调Notch1及Dll4的mRNA水平[5]。基于此，本研究以hUCMSCs为体外研究细胞模型，以前期课题组合成的重组腺病毒Ad-HGF为研究对象，系统分析Ad-HGF通过Notch1/Dll4信号通路的调控作用对hUCMSCs增殖能力、细胞周期、细胞毛细管腔状结构形成、迁移能力等功能的影响；Notch1/Dll4信号通路及血管动静脉标志物转录水平及蛋白表达水平的变化。最终阐明HGF与hUCMSCs信号通路的关系及机制，揭示Ad-HGF促进动静脉血管分化的作用，具有重要的理论意义和应用价值。一、人脐带间充质干细胞的分离培养、鉴定及诱导分化。方法：取正常足月生产新生儿脐带，采取组织贴壁法分离原代hUCMSCs，观察细胞生长形态。采取流式细胞仪技术检测hUCMSCs细胞表型及细胞周期。通过成神经细胞诱导和成脂肪细胞诱导鉴定hUCMSCs的诱导分化能力。结果：成功分离和培养hUCMSCs原代细胞。细胞经流式细胞仪鉴定高表达间质细胞标志CD44（96.73%）和CD105（96.10%），整合素受体CD29（99.53%）；低表达造血系标志CD34（0.8%）和CD45（1.91%），人白细胞抗原HLA-DR（1.41%），符合hUCMSCs细胞表型特征。细胞周期检测大部分hUCMSCs处于G0/G1期。hUCMSCs成神经细胞诱导，出现神经元样细胞，Nestin蛋白免疫组化检测阳性。hUCMSCs成脂肪细胞诱导，出现空泡样脂滴，油红O染色检测阳性。结论：成功分离及培养了具有多向分化潜能的hUCMSCs，可以用于后续实验的研究。二、人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定。方法：根据Gene Bank中Notch1基因mRNA序列（NM017617）设计合成shRNA序列，并且连接到pGenesil-1.1质粒上，酶切及测序鉴定。通过体外同源重组将Notch1-shRNA表达框转移至腺病毒表达载体pGsadeno上，酶切线性化后脂质体转染包装细胞HEK293，制备获得重组腺病毒。腺病毒转染hUCMSCs，观察细胞形态及GFP蛋白的表达，提取总RNA和总蛋白，RT-PCR及Western Blot检测细胞Notch1的转录及蛋白表达水平。结果：经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确。转染hUCMSCs后，RT-PCR及Western Blot检测，可显著抑制细胞Notch1的基因转录及蛋白表达，对基因转录沉默效率约为68.04%（P＜0.05）；对蛋白表达默效率约为80.32%（P＜0.05）。结论：成功构建了重组腺病毒rAd5-Notch1-shRNA，能高效转染hUCMSCs细胞，具有Notch1基因沉默效应。三、Ad-HGF诱导hUCMSCs向血管动静脉内皮细胞分化的体外研究。方法：以hUCMSCs为研究对象，实验分为五组：腺病毒Ad-GFP组、Ad-GFP-Notch1-shRNA组（简称为Ad-shRNA组）、Ad-GFP-NICD组（简称为Ad-NICD组）、Ad-HGF组和空白对照组。首先通过MTT实验检测各组细胞生存率，判定各组腺病毒的最佳感染MOI。显微镜下观察各组细胞形态。ELISA实验检测Ad-HGF组细胞培养上清中HGF的表达水平。MTT法测定OD490nm值，绘制细胞生长曲线。流式细胞仪检测各组细胞周期情况。随后分别检测各组细胞贴壁能力、迁移能力及体外成血管能力。实时定量荧光PCR法检测Notch信号通路中：Notch1、Dll4及Hey-2基因；静脉标志物EphB4基因；动脉标志物ephrin B2基因的转录水平。最后WesternBolt检测Notch1、EphB4及ephrin B2蛋白的表达。结果：Ad-GFP组最佳MOI为100倍；Ad-NICD组、Ad-shRNA组及Ad-HGF组最佳MOI为50倍。转染后镜下观察，除Ad-HGF组外，其他各组，均出现GFP的表达；Ad-NICD组，细胞增殖速度快，形成多个不完整的管腔样结构；Ad-HGF组，细胞分散生长，早期增殖速度较快，随后出现了大量的分泌小泡。ELISA检测Ad-HGF组培养48h后，上清中HGF的表达与对照组相比显著增多（P＜0.05），96h达到峰值562.97±27.09pg/mL。Ad-NICD组和Ad-HGF组能显著促进细胞增殖，在48、72、96h时具有显著差异（P＜0.05）；Ad-shRNA组能抑制细胞增殖，在72h时具有显著差异（P＜0.05）。流式细胞仪检测，Ad-NICD组细胞S期比例有较大增高（36.02%），细胞DNA复制活跃，具有较强增殖活性。细胞贴壁实验中，Ad-HGF组在12、16、20h及Ad-NICD组在20h细胞贴壁率大于对照组（P＜0.05）；Ad-shRNA组在8、12、16h细胞贴壁率小于对照组（P＜0.05）。Transwell小室实验发现Ad-HGF组及Ad-NICD组能促进细胞迁移，而Ad-shRNA组抑制细胞迁移（P＜0.05）。体外成血管实验，Ad-NICD组和Ad-HGF组出现了明显的管状结构，其余各组未见。实时定量荧光PCR检测，Ad-HGF组及Ad-NICD组的Notch1、Dll4、Hey-2基因转录水平高于其余各组（P＜0.05），而Ad-shRNA组则低于其余各组（P＜0.05），Ad-GFP组与空白对照组之间、Ad-HGF组与Ad-NICD组之间无统计学差异（P>0.05）。静脉标志物EphB4基因，Ad-GFP组、Ad-HGF组及Ad-shRNA组与空白对照组相比较，无统计学差异（P>0.05），而Ad-NICD组基因转录水平高于空白对照组（P<0.05）。动脉标志物ephrin B2基因，Ad-GFP组、Ad-shRNA组和空白对照组之间、Ad-HGF组与Ad-NICD组之间，无统计学差异（P>0.05），Ad-HGF组和Ad-NICD组细胞的ephrin B2基因转录水平高于其余各组（P<0.05）。Western Blot检测，Ad-HGF组与Ad-NICD组高表达Notch1蛋白和ephrin B2蛋白，Ad-shRNA组低表达Notch1蛋白和ephrin B2蛋白，具有统计学差异（P<0.05）。结论：HGF能通过激活Notch1/Dll4信号通路诱导hUCMSCs向动脉血管分化。