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背景:现阶段治疗上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)仍是肿瘤临床工作中所面临的的一大挑战。首次根治性治疗即肿瘤细胞减灭术及术后进行以铂类为基础的联合化疗对于绝大部分卵巢肿瘤患者是有效的,缓解率可以达到80%,但残留下的肿瘤细胞会成为隐患。复发患者因肿瘤侵润周围正常脏器或远处转移,二次手术切除概率低,患者会选择周期化疗控制疾病进展。而反复、多药联合常导致多耐药发生。复发、耐药两大主要因素使得卵巢癌始终位于妇科肿瘤病死率首位。怎样预测,如何逆转耐药的发生,如何拟定有效的治疗策略,成为卵巢癌治疗研究领域的重点及难点。卵巢癌腹水常预示不良预后,至今无有效控制手段。临床多以反复穿刺引流和腹腔灌注化疗为主要治疗方式。恶性腹水形成了卵巢癌特殊的肿瘤微环境,与肿瘤的异质性和肿瘤生物行为学关系密切。很多学者对腹水成分进行分离鉴定,分析发现恶性腹水中的细胞因子与卵巢癌疾病预后关系密切,可作为肿瘤的特异性标志物;恶性腹水中的可溶性成分参与多种信号通路活化,促进细胞的增殖、侵袭、免疫逃逸、转移及抗药;腹水中的细胞成分会表达肿瘤干细胞表型,恶性度高,与肿瘤的分化及异质性关系密切。尽管关于腹水探究近年来备受关注,但是以腹水作为整体,探讨其对于卵巢癌的影响的研究并不多。目的:本实验中我们从临床患者中获取卵巢癌腹水非细胞成分,以其为培养条件对卵巢癌细胞进行培养,了解腹水对肿瘤细胞系的增殖、凋亡、耐药等作用的影响,并探究可能涉及的机制,为腹水对卵巢癌进展作用提供实验基础。方法:1.以超声引导腹腔穿刺引流的方式获得38例卵巢癌腹水,通过高速离心机过滤分离出腹水非细胞成分,用以培养卵巢癌SKOV3细胞系,并分为实验组(腹水非细胞成分培养组)和对照组(胎牛血清培养组)。2.采用MTT实验检测卵巢癌腹水非细胞成分对SKOV3细胞系的生长增殖情况影响,并绘制相关细胞生长曲线,比较两组差异。4.对实验组和对照组的细胞行不同浓度药物(顺铂及Akt特异性抑制剂LY294002)的处理,采用MTT实验检测各组SKOV3细胞对顺铂、LY294002及两药联合的敏感程度的变化情况。5.应用化疗药物(顺铂、LY294002及顺铂联合LY294002)处理不同培养条件的SKOV3细胞系24小时,应用流式细胞术检测不同组细胞凋亡变化情况。6.采用Western Blot法检测耐药相关蛋白、细胞周期相关蛋白、凋亡通路相关蛋白在胎牛血清处理组和腹水非细胞成分处理组的表达水平情况,并比较两个差异变化。7.采用Western Blot检测PI3K/Akt通路相关蛋白在腹水非细胞成分处理组及血清处理组的表达水平改变情况,了解该通路在本实验的作用。结果:1.MTT实验实验结果显示;腹水非细胞成分可促进肿瘤细胞的增殖,腹水微环境与肿瘤增殖关系密切,由细胞增殖曲线可以看出,相对血清培养组,腹水非细胞成分培养的SKOV3细胞系生长增殖较快,增殖平台期也相应提前,细胞倍增时间明显缩短(P<0.05)。2.对实验组(腹水非细胞成分培养组)和对照组(血清培养组)的细胞行不同浓度顺铂处理后,采用MTT实验检测各组SKOV3细胞对顺铂敏感性变化情况。结果显示:腹水非细胞成分培养后顺铂对SKOV3细胞系的抑制情况明显的低于血清培养组,实验组顺铂的IC50值为16.23±2.45ug/ml,而对照组顺铂的IC50值则为7.91士0.19ug/ml,二者差异明显(P<0.001),实验组细胞对顺铂药物敏感程度下降了约1.05倍,并且在相同浓度的顺铂作用下,实验组细胞抑制率均低于对照组(p<0.05)。3.检测不同浓度LY294002对实验组及对照组细胞抑制率情况,可见经不同浓度刺激后,各组SKOV3细胞系抑制率随浓度的升高而升高,实验组在相同浓度LY294002刺激下其SKOV3细胞系抑制率均低于对照组(P<0.05)。4.联合LY294002及顺铂刺激实验组及对照组SKOV3细胞系,LY294002可逆转腹水非细胞成分所导致的顺铂耐药情况,接受LY294002的SKOV3细胞系其抑制率明显高于未接受LY294002处理的细胞(P<0.05)。5.流式细胞术检测发现,在未接受药物处理前,实验组和对照组细胞凋亡情况无明显差异(P>0.05),顺铂作用24小时后,腹水非细胞成分培养的SKOV3细胞系凋亡情况显著的低于对照组(P<0.05),顺铂联合LY294002作用后24小时后,由腹水非细胞成分导致的抗凋亡情况可逆转,接受LY294002预处理的SKOV3细胞系凋亡显著高于未接受LY294002组(p<0.05)。6.Western Blot结果显示:卵巢癌腹水非细胞成分可增加耐药相关蛋白P-gp和MRP1表达,可增加细胞周期蛋白Aurora-A和53BP1表达(P<0.05),可增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达(p<0.05),但促凋亡蛋白Bax表达无显著增加(p>0.05),凋亡通路蛋白无活化切割,PI3K/Akt通路相关蛋白表达增高(p<0.05)。7.接受LY294002处理后,腹水非细胞成分培养组SKOV3细胞的Bcl-2蛋白表达下降,但对耐药相关蛋白P-gp和MRP1、周期相关蛋白Aurora-A和53BP1表达无明显影响。结论:1.经卵巢癌的腹水非细胞成分培养后,SKOV3细胞株的生长增殖能力提高,增殖平台期提前,细胞倍增时间明显缩短。2.卵巢癌的腹水非细胞成分可降低SKOV3细胞株对顺铂的抑制率,由顺铂的细胞引起的细胞凋亡被抑制,该凋亡及抑制情况可被PI3K抑制剂LY294002逆转,说明其卵巢癌腹水非细胞成分的促耐药及抗凋亡过程可能与PI3K/Akt通路相关。3.卵巢癌的腹水非细胞成分可促进肿瘤细胞耐药蛋白P-gp和MRP1表达,可促进细胞周期蛋白Aurora-A和53BP1的表达,可促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,但与促凋亡蛋白Bax无关,PI3K/Akt通路参与腹水非细胞成分对Bcl-2的调控。