【摘 要】
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背景与目的新生血管的生成是肿瘤生长和转移的关键环节之一,因而阻断或抑制新生血管的生成是抗肿瘤治疗的有效策略。近年来人们对血管的生成机制进行了广泛深入的研究,已证明血管的生成受多种相关因子的调节,相继发现了多种血管生成因子和血管生成抑制因子。以血管生成为靶点治疗肿瘤已成为肿瘤治疗研究的热点,有多种血管生成抑制剂相继进入临床试验阶段。人纤溶酶原Kringle5（简称K5）是新近发现的一种血管生成抑制因
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背景与目的新生血管的生成是肿瘤生长和转移的关键环节之一,因而阻断或抑制新生血管的生成是抗肿瘤治疗的有效策略。近年来人们对血管的生成机制进行了广泛深入的研究,已证明血管的生成受多种相关因子的调节,相继发现了多种血管生成因子和血管生成抑制因子。以血管生成为靶点治疗肿瘤已成为肿瘤治疗研究的热点,有多种血管生成抑制剂相继进入临床试验阶段。人纤溶酶原Kringle5（简称K5）是新近发现的一种血管生成抑制因子。它能作用于增生的血管内皮细胞,抑制细胞的增殖、迁移,并能诱导细胞凋亡,是最强的内源性血管增生抑制剂之一。由于K5区抑制内皮细胞增殖和抗迁移能力都较强,这使得K5的应用价值更为突出。目前,K5主要是通过基因工程重组技术获得,其纯化复杂,且得率较低,而且K5的相对分子量偏大。因此,研究K5的功能性区域及蛋白的空间结构,直接克隆出了简化的K5,并将其与谷胱甘肽S-转移酶（GST）进行融合表达,以便获得易于纯化的K5蛋白。本实验的目的在于,寻求一条高效且快速获得K5蛋白的途径,为抗肿瘤药物的开发奠定基础。方法从人膀胱癌组织中提取总RNA,经过合理设计引物,利用RT-PCR直接得到简化的K5基因。将该基因克隆至原核表达质粒pGEX-5X-1,再将此重组载体转化大肠杆菌BL-21,经PCR检测、酶切鉴定及测序鉴定阳性克隆的正确。经IPTG诱导阳性克隆表达融合蛋白,SDS-PAGE观察表达产物。结果成功构建K5/pGEX-5X-1原核表达载体,诱导BL-21成功表达获得K5融合蛋白。结论外源性蛋白K5在原核细胞中成功表达,为K5蛋白的获得提供了一条切实可行的途径;为后续实验中,对蛋白的活性研究及纯化制备、探讨K5对血管内皮细胞的抑制作用、在肿瘤动物模型中对肿瘤生长、侵润迁移的抑制作用的研究,以及抗肿瘤新药的开发奠定了基础。
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