大肠杆菌直接氧感应蛋白（Direct Oxygen Sensor from E.coli，EcDOS or DosP）是一种含有血红素的氧气感应磷酸二酯酶，一旦其N端的感受结构域血红素复合物与氧气结合，C端催化结构域的结构就会改变，进而激活其磷酸二酯酶活性，加速催化大肠杆菌体内一种重要第二信使c-di-GMP降解为l-di-GMP，从而调控磷酸化、离子结合、气体结合、DNA结合、运动性、毒性、细胞间信号传导以及生物膜形成等重要生物学功能。最近已有研究证实有氧条件下，硫化氢也可以增加EcDOS对c-di-GMP的磷酸二酯酶活性，但是具体机制尚不清楚。　　本研究主要探索有氧条件下硫化氢增加野生型全长EcDOS磷酸二酯酶活性的机制。利用EcDOS调控结构域上两个重要位点Met95和Arg97突变得到的六个突变体来辅助分析上述机制。研究中结构分析主要运用岛津双波长分光光度计进行，光谱学结果显示，加入硫化氢后，野生型和六个突变体光谱均有改变，即硫化氢对其均有作用。此后，我们又分别利用比色法和高效液相色谱法探究加入硫化氢之后酶活性的变化，从而了解EcDOS结构变化与功能的关系，并进一步推断有氧条件下野生型EcDOS与硫化氢反应的机制。　　因此，本文将主要涉及以下方法：（1）使用镍亲和层析柱（GE Health care，Histrap-HP）从超声破碎的菌液中分离纯化出全长EcDOS野生型以及突变型蛋白，并用SDS-PAGE验证其纯度，保证样品满足实验要求。（2）应用商品化的磷酸盐定量试剂盒Biomol Green配合酶标仪间接测得酶活性，并将加硫化氢和未加硫化氢的酶活性进行对比分析，同时比较硫化氢对不同突变体酶活性的影响，分析Met95和Arg97两个重要位点的作用。（3）用高效液相色谱法测定酶促反应之后反应液中底物和产物的浓度，从而得到酶活性数据，并与Biomol Green方法得到的数据比对，互相印证结果。　　通过以上实验，本研究得到以下结论：（1）Met95和Arg97是EcDOS与血红素上结合的配体相互作用的关键位点，突变之后将显著影响EcDOS的结构与功能，影响其与气体信号分子硫化氢的结合，尤其是R97A和R97I中血红素修饰物的产生提示其构象的改变，而这一改变将影响其活性。（2）光谱结果显示WT（野生型）和Met95突变体有Fe(III)-SH heme和Fe(II)-O2复合物形成，WT和M95H形成Fe(III)-SH复合物，进一步被还原为Fe(II)-O2复合物，M95A和M95L形成的Fe(III)-SH复合物没有发生进一步的还原，而Arg97突变体中R97A和R97I形成血红素修饰物verdoheme，R97E形成一个新的复合物Fe(II)，这是目前发现的第一个可以分离的没有结合氧气或其他外来配体的复合物（3）两种酶活性测定方法获得的酶活性数据显示，实验条件下，硫化氢可以增加WT和M95突变体的酶活性，对R97突变体的酶活性没有显著性影响。以上结果显示，有氧条件下，在硫化氢与全长 EcDOS作用过程中，Fe(III)-SH heme和Fe(II)-O2复合物对酶活性的增加起主要作用。