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为了深入研究iNOS基因功能表达在阿片耐受和依赖机制中的调控作用，本研究采用分子生物学技术和分子药理学方法，首先构建诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） cDNA的逆转录病毒载体和真核表达载体，将重组iNOS基因导入NG108-15细胞，建立稳定表达iNOS基因的细胞。用阿片激动剂长时程作用建立的iNOS基因转染细胞的阿片耐受和依赖模型，对iNOS基因表达与δ-阿片受体耦联AC-cAMP系统、NO-cGMP系统和Ca2+系统之间的相互关系进行研究。进一步探讨了干预NMDA—NO—cGMP通路的药物抗阿片类耐受成瘾的神经生化机制。本研究不仅对阐明iNOS基因表达调控及其对细胞生物学功能影响具有重要的理论价值，而且为阿片耐受依赖中阿片受体和NMDA受体介导的信号转导系统相互作用提供了实验依据，也为寻找和设计抗阿片耐受成瘾治疗药物提供了新的研究策略和药物作用靶点。 1．逆转录病毒载体介导的诱导型NO合酶基因导入NG108—15细胞 应用重组DNA技术，首先从质粒pKSiNOS中，分离编码小鼠巨噬细胞iNOS的全长cDNA，克隆于中间载体pSP72，调整插入片段二端的酶切位点，进而构建含有巨细胞病毒（CMV）启动子、iNOS基因和neo基因的逆转录病毒载体pLNCXiNOS。用限制性酶切分析和iNOS基因引物进行PCR鉴定，重组质粒pLNCXiNOS中iNOS基因插入片段大小和方向是正确的。采用LipofectAMINE介导的基因转移技术将iNOS基因导入NG108—15细胞，获得G418抗性克隆，命名为NG—pLNCXiNOS细胞。Southern杂交、PCR扩增鉴定及RT—PCR和Western杂交分析，证实NG—pLNCXiNOS细胞有外源性iNOS基因整合、转录和表达：NADPH—d组织化学和iNOS抗体免疫组化染色表明，细胞胞浆中有iNOS基因功能表达；酶活性测定增高2～4倍，连续传代半年以上酶活性稳定，NOS抑制剂浓度依赖性降低酶活性。首次成功地建立了重组iNOS基因稳定表达的神经细胞株。 2．重组诱导型NO合酶基因真核表达载体的构建及其在神经细胞中的表达 设计并构建来源于巨噬细胞iNOS cDNA的真核表达载体pCMViNOS，其特点是携有iNOS的cDNA序列，包括编码iNOS完整开放阅读框架，但删除5’端部分非编码区，有利于高效表达。还含有CMV强启动子、ploy（A）加接信号和neo标志基因，具有转染多种哺乳类细胞的通用性。将质粒pCMViNOS转染到NG108—15细胞也获得另一株功能表达iNOS基因的工程细胞。 3．iNOS基因表达与阿片类药物耐受依赖的受体及信号转导机制