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目的：
运用消痰散结方药物血清干预人胃癌MKN-45细胞,观察药物血清对胃癌细胞侵袭转移力及其相关基因E-Cadherin基因甲基化、mRNA、蛋白等的影响,初步探讨消痰散结方抗肿瘤的侵袭转移机制。
方法：
1.SD大鼠,6周龄,雄性20只,体重350g±20g,随机分成空白对照组、消痰散结方1、2、3组,分别灌胃予以不同浓度的消痰散结方水煎剂,灌药5日后股动脉活体取血,制备空白药物血清及1倍、2倍、4倍剂量消痰散结方药物血清。
2.人胃癌MKN-45细胞培养至对数生长期,随机分成5组,空白对照组、空白药物血清组及消方药物血清1、2、3组,分别加入对应的药物血清,空白对照组不加任何药物血清,置于37℃,5％CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h、96h,通过观察药物血清对人胃癌MKN-45细胞增殖和凋亡的影响,确定药物血清的适宜剂量和适宜时间:CCK8法检测消痰散结方药物血清对MKN-45细胞增殖的影响;倒置相差显微镜下观察细胞形态改变;Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双标记法流式细胞术检测消痰散结方药物血清诱导MKN-45细胞后细胞凋亡的情况。
3.人胃癌MKN-45细胞培养至对数生长期,随机分成3组,空白对照组,空白药物血清组及消方药物血清组,Transwell侵袭实验观察消痰散结方药物血清对人胃癌MKN-45细胞体外侵袭转移的影响。
4.人胃癌MKN-45细胞培养至对数生长期,随机分成4组,空白对照组、空白药物血清组、消方药物血清组、5-Aza-CdR组,Western-blot测定E-Cadherin蛋白,RT-PCR测定E-Cadherin基因mRNA,Methylight法测定E-Cadherin基因甲基化,观察消痰散结方药物血清对E-Cadherin表达各个环节的影响。
结果：
1.制备成空白药物血清及1倍、2倍、4倍剂量消痰散结方药物血清。
2.消痰散结方药物血清1、2、3组均能不同程度地抑制人胃癌MKN-45细胞的增殖,细胞发生了脱落,变圆,折光率下降等形态学变化,AnnexinV-FITC/PI双标记法检测显示消痰散结方药物血清可诱导细胞发生凋亡;消痰散结方药物血清2组人胃癌MKN-45细胞药物血清干预72h后,抑制细胞增殖较其他组最佳,增值率为78.41％,差异有统计学意义,其早期凋亡率为3.45％,晚期凋亡率为11.93％。
3.Transwell侵袭实验结果:消方药物血清组穿膜细胞个数较其他两组少,差异有统计学意义(P＜0.05)。
4.Western-blot结果:消方药物血清组及5-Aza-CdR组E-Cadherin蛋白表达明显升高,较其他组差异有统计学意义;RT-PCR结果:消方药物血清组及5-Aza-CdR组E-Cadherin mRNA表达明显升高,较其他组差异有统计学意义;Methylight结果:人胃癌MKN45细胞中E-Cadherin基因启动子明显甲基化(PMR＞4),消方药物血清以及5-Aza-CdR干预细胞72h后,E-Cadherin基因甲基化水平均有所降低,与其他组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其中5-Aza-CdR组E-Cadherin基因甲基化水平明显低于消方药物血清组(P＜0.05)。
结论：
1.消痰散结方药物血清可抑制人胃癌MKN-45细胞的增殖,促进其凋亡;
2.消痰散结方药物血清可抑制人胃癌MKN-45细胞体外侵袭转移;
3.消痰散结方药物血清可降低E-Cadherin基因启动子区域甲基化水平,增加E-Cadherin基因mRNA及蛋白表达,可能为其抑制胃癌细胞体外侵袭转移机制之一。