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F-box蛋白是一类含有F-box结构域,在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底物识别特性的蛋白质家族。F-box蛋白作为Skplp-cullin-F-box蛋白复合体的组分,参与了体内26S蛋白酶体的降解途径。F-box这类蛋白质在植物体内参与光形态建成、激素的信号转导、自交不亲和以及花器官分化等多个发育过程发挥重要作用。在拟南芥中有大量的F-box被报道,但是在水稻的研究才刚刚开始。
本论文通过反向遗传学手段初步研究了水稻中的一个具有Kelchrepeats结构域的F-box蛋白,序列同源性分析表明其编码的蛋白序列中含有F-box(N端第94到第114个氨基酸)和Kelchrepeats结构域(C端第159到第265个氨基酸),将其命名为OsFBK12。超表达该基因的转基因水稻植株表现出种子萌发延迟,分蘖数减少,穗子变长,粒形变大,衰老延迟的表型,而该基因的RNAi转化株系表现出种子萌发提前,株型紧凑,分蘖数增加,穗子变短,粒形变小,早衰的表型。这预示着水稻OsFBK12具有不同于以往报道的F-box蛋白对植物生长发育调控的新功能。
我们用全长的OsFBK12蛋白利用酵母双杂交系统建库筛选到一个水稻中的OSK1(水稻中的SKP1蛋白),用酵母双杂交分析方法及BiFC实验均验证了OsFBK12这一结论,初步表明OsFBK12以依赖于SCF复合体的形式发挥功能。
与此同时,我们用全长的OsFBK12蛋白和只含有Kelchrepeats结构域的OsFBK12蛋白,利用酵母双杂交系统建库筛选到一个水稻OsSAMS1,编码硫腺苷甲硫氨酸合成酶,催化甲硫氨酸和ATP反应生成SAM。SAM在生物体所有细胞代谢中均起重要作用,是乙烯合成的前体。Westernblot检测OsFBK12-RNAi转基因水稻中,OsSAMS1蛋白的表达量升高,超表达转基因水稻中对应的OsSAMS1蛋白的表达量降低。利用烟草表达系统,我们发现在烟草系统内OsFBK12蛋白可以促进OsSAMS1的降解。超表达OsFBK12的转基因水稻和OsSAMS1的RNAi干扰植株都表现出种子萌发延迟的表型,这一表型可以被外源添加SAM所弥补。我们通过乙烯的敏感性试验证明,这两种转基因水稻植株中表现出的乙烯敏感性基本与野生型一致,是对乙烯敏感的。而超表达OsSAMS1的转基因水稻和OsFBK12的RNAi干扰植株都表现出对乙烯的略微不敏感。我们通过芯片及Real-timePCR验证了乙烯信号途径中所报道的基因,结果表明,在转基因植株中,没有信号途径上游的基因发生明显的变化。因此我们推测,OsFBK12蛋白通过降解OsSAMS1影响到乙烯的合成途径。
叶片的衰老对整体植株而言具有非常重要的意义。随着叶片的衰老,同化产物逐渐向籽实转移,叶片衰老最快的时期正是种子与鲜重快速增长的时期。OsFBK12通过降解其底物蛋白OsSAMS1的含量参与到乙烯的合成途径,影响到植株的衰老,从而影响到种子的灌浆以及粒型的变化。这些实验结果阐明OsFBK12通过泛素途径介导的底物蛋白降解机制调控水稻衰老及粒型发育的内在机理,并且为水稻这一重要农作物的分子育种改良提供理论依据。