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目的:创伤、肿瘤等造成的颌面骨缺损是整形外科医生面临的重大挑战,但目前尚未找到令人满意的修复材料。近年来,组织工程学的迅速发展为临床骨缺损的治疗带来了新的希望。己被广泛应用的骨修复材料金属钛(Titanium)和钛合金(Ti6Al4V,Ti),具有优异的机械性能、生物相容性、化学稳定性。不过此类材料也存在生物惰性,其与骨的弹性模量不匹配,这样会导致材料与组织结合不稳定。这些问题都需要解决,因此不同的钛表面改性技术被提出,来满足临床应用要求。常见的植入物表面改性的方法主要包括两个方面:一是使植入物的结构变得疏松;二是植入物表面涂层,加载生物活性分子或药物对植入物进行表面修饰。这些方法可以有效提高植入物的生物活性与相容性,有利于改善植入修复效果。石墨烯的生物相容性高,在细胞培养领域有明显的性能优势,此外其延伸性、柔韧性和环境适应性也良好,对细胞粘附和迁移可起到促进作用。近年来在骨组织工程方面,这种材料的应用价值已经明显表现出来。相关实验研究结果表明基材涂覆石墨烯后可显著促进干细胞的生长与分化。脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)有很强多向分化潜能,在组织修复方面有很高的应用价值,这主要和干细胞的增殖以及旁分泌作用有关。细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs),是胞吞作用后产生的多泡小体进入到细胞外产生的微小囊泡。外泌体(Exosome,Exos)作为一种直径30~150nm的EVs,在很多机体生理过程中都发挥一定调节作用,和细胞信息传递密切相关。脂肪干细胞来源外泌体(Adipose stem cells derived exosome,ADSCs-Exos)发挥着细胞间信息交流的作用,已经被广泛证实在组织再生方面发挥着重要作用,其中就有研究表明其能够作为“诱导因子”促进骨组织再生修复。支架材料能够为“诱导因子”促进干细胞的分化提供载体。钛合金通过表面改性技术可以赋予其良好的机械性能和生物学功能,石墨烯因其独特的结构和性能,能够促进干细胞的黏附和分化。将种子细胞与三维支架材料复合培养后植入体内的共培养方法已得到学术界的认可。这些提示我们,以体内构建的方式制备能够负载脂肪干细胞及其外泌体的石墨烯涂层多孔钛合金支架从而构建拥有更加良好性能的组织工程骨成为可能。本文针对骨修复领域传统钛合金的缺陷问题进行分析,开展改性研究,选择多孔钛合金为基材,基于微弧氧化(micro-arc oxidation,MAO)技术制备出复合石墨烯涂层的多孔钛合金支架(Gr-Ti)材料,通过复合脂肪干细胞及外泌体,评价复合支架材料对于骨修复及骨整合的影响,为骨组织工程与干细胞疗法联合应用提供理论依据,同时为临床新型骨修复材料的研发提供支持,此方面相关研究尚未见报道。方法:1.通过选区激光熔融(Selective laser melting,SLM)技术设计制备3D打印的多孔钛合金(Ti)支架材料,应用MAO技术在其表面复合石墨烯涂层。基于扫描电镜方法研究了其表面形态和孔隙率变化情况,利用能谱分析法研究了改性材料是否出现了石墨烯特征峰;通过3D激光共聚焦显微镜检测支架表面粗糙度的改变;且对其力学性能做了检测;2.基于吸脂手术采集人脂肪中的ADSCs,体外验证支架材料的细胞毒性和细胞增殖活性,探讨Exos复合Gr-Ti支架对ADSCs成骨分化的影响。3.体外探究Wnt信号通路在Exos促进Gr-Ti支架成骨分化中的作用。4.提取兔ADSCs及其外泌体,通过构建兔下颌骨临界骨缺损模型,体内验证Exos及Gr-Ti支架对ADSCs成骨分化的影响。结果:1.多孔钛合金的孔隙率为69±3%,孔径为546±21μm,SEM及表面成分分析结果显示3D多孔钛合金支架表面的石墨烯涂层制备成功;表面粗糙度结果显示Gr-Ti组的表面粗糙度明显增高;力学试验结果反映该支架具有与骨组织相适应的弹性模量,石墨烯涂层和Ti6Al4V材料的力学性能关系不明显。2.体外实验证实Ti和Gr-Ti支架材料无细胞毒性,且复合石墨烯涂层的Gr-Ti支架较无涂层Ti支架可以更好的促进细胞黏附和增殖。3.体外q PCR和Western blot检测发现,Gr-Ti/Exos组的ADSCs成骨分化相关基因和蛋白Runx2、ALP和Osterix的表达上调,同时Wnt信号通路关键蛋白Wnt-1、Axin2、β-catenin的表达也显著增加。加入Wnt通路抑制剂DKK,成骨相关蛋白和Wnt通路关键蛋白均表达下降。4.在体内实验中,Gr-Ti/Exos组的成骨能力和骨缺损修复情况优于Gr-Ti组。通过组织染色能够证实,Gr-Ti/Exos组的骨组织再生情况明显好于Gr-Ti组。结论:1.SLM技术能够制备3D多孔钛合金支架,其弹性模量与骨组织接近,减少了应力遮挡。MAO法可以在支架表面制备石墨烯涂层,该涂层与钛合金基材稳定结合。石墨烯涂层增加了支架表面粗糙度,但没有改变其力学性能。2.Gr-Ti具有良好的生物相容性,复合外泌体的Gr-Ti支架能够促进细胞黏附和增殖。3.复合外泌体的Gr-Ti支架可以通过Wnt信号通路促进ADSCs成骨分化。4.复合外泌体的Gr-Ti支架可以更好促进兔下颌骨临界骨缺损的修复。