耳聋是影响人类生活质量的主要疾病之一,当前耳蜗植入成为治疗双侧重度一极重度听力损伤的主要手段。但是,研究发现在多数耳蜗植入病例中,患者在术后表现出残余听力损害。在众多致损伤因素中,普遍认为耳蜗功能损伤主要与电极插入有关。电极插入创伤,造成受损耳蜗感觉性上皮细胞内经由氧化应激(oxidative stress)过程产生反应性氧自由基(ROS),ROS被认为与迟发出现的内耳毛细胞死亡有关。多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase.PARP],是一种非组蛋白染色体蛋白质,广泛存在于真核细胞内,具有蛋白修饰和核苷酸聚合作用,在DNA链断裂的修复中发挥着重要作用。环境刺激、自由基或氧化剂(如硝基酪氨酸)和基因毒性介质可导致DNA链断裂或形成缺口,PARP作为DNA断裂的分子感受器之一,可被DNA链断裂激活,并以尼克酰胺腺嘌吟二核苷酸(NAD~+)为底物,将其催化裂解为ADP-核糖(ADP-ribose)和尼克酰胺两部分,ADP-核糖则转移至核蛋白进行DNA损伤修复。但是,当大量DNA损伤时,PARP出现过度活化,以NAD~+为底物,形成大量的(ADP-核糖)聚合物,并在尼克酰胺重新生成NAD~+时消耗ATP,耗竭能量,使细胞发生不可逆严重损伤及致最终发生细胞死亡。PARP过度活化已被证实与许多神经系统疾病关系密切,这些疾病的病理过程中都有氧化应激损伤参与。在内耳实验研究中,也证实PARP在噪声损伤导致内耳病变过程中发挥作用。线粒体在细胞损伤过程中起着重要作用。凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor,AIF)存在于线粒体内外膜之间,当细胞受到特定信号如凋亡信号刺激后,AIF从线粒体快速释放到胞浆,继之转移到核内。在细胞核内,AIF与核酸内切酶共同作用于DNA,导致DNA断裂成大片段和染色质凝集,细胞发生凋亡或坏死。研究表明,AIF从线粒体释出有赖于PARP激活后启动的核信号放大传递到线粒体所致。c-Jun氨基末端激酶c-Jun N-terminalkinases(JNK)可参与PARP导致线粒体功能障碍和细胞死亡的过程,并和氧化应激损伤导致的听神经元凋亡有关。随着拥有残余听力的患者选择耳蜗植入的需求上升,以及高频听阈存在重度听力缺失、低频听阈有听力的患者采用双模电声刺激即联合应用助听器和耳蜗植入装置的人数的增加,对于耳蜗植入术中、术后感音神经功能的保护显得极为必要。因此对于电极插入创伤相关性听力下降的病理生理机制的研究和认识具有重要意义,并有助于设计干预性保护治疗方案应用于拥有残余听力的耳蜗植入患者。本研究中,我们以豚鼠为研究对象,建立植入电极插入创伤模型,并检测创伤后耳蜗组织中PARP、JNK、AIF的表达,探讨其在内耳功能损伤中的作用及机制。在此基础上,研究全反式维甲酸(ATRA)对于创伤后内耳毛细胞损伤以及听功能保护作用。本研究共分三部分进行。第一部分氧化应激和多聚ADP-核糖聚合酶在内耳电极插入创伤中的作用目的:探讨过氧亚硝酸阴离子和多聚ADP-核糖聚合酶在豚鼠内耳电极插入创伤中所发挥的作用。方法:1.豚鼠内耳电极插入创伤模型的建立和分组:采用内耳圆窗膜切开、电极插入鼓阶的方法建立电极插入创伤模型,分组如下:单纯电极插入创伤组(EIT)12耳、对照组1(C1)12耳、电极插入创伤+3-AB(PARP抑制剂)组(EIT+AB)12耳、对照组2(C2)12耳和手术对照组(S)12耳。2、听性脑干电位(ABR)检查:各实验组动物在术前和术后3小时测量ABR阈值。3、术后3小时各实验组内耳组织硝基酪氨酸(NT)和多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)表达,采用免疫荧光技术观察其表达部位及强度。4、采用蛋白印迹技术(western blot)检测术后3小时各实验组内耳组织中NT和PARP蛋白表达水平。结果:1、术后3小时,电极插入手术耳(EIT和EIT+AB组)ABR阈值明显增高,听功能受损,对照组无明显ABR阈值改变,手术对照组ABR阈值轻度增加。2、术后3小时,NT在电极插入创伤后内耳毛细胞中明显表达,应用3-AB,NT表达减弱。对照组和手术对照组均未见表达。3、术后3小时,PARP在电极插入创伤后内耳毛细胞核中明显表达,应用3-AB,PARP表达减弱。对照组和手术对照组均未见表达。结论:1.豚鼠耳蜗电极插入能引起听功能下降、内耳NT和PARP明显表达,表明电极插入创伤引起内耳听毛细胞的氧化应激和PARP活化引起内耳听功能损失。2.对PARP活化的抑制,能减弱电极插入创伤后内耳的氧化应激反应,并对听功能产生保护作用。第二部分电极插入创伤后PARP、AIF和3NK在内耳毛细胞的表达目的:通过研究PARP、JNK和AIF在电极插入创伤后内耳毛细胞的表达变化,进一步了解电极插入创伤导致的听毛细胞损伤机制。方法:1.豚鼠内耳电极插入创伤模型的建立和分组:建立电极插入创伤模型,分组如下:单纯电极插入创伤组(EIT)12耳、对照组1(C1)12耳,电极插入创伤+3-AB(PARP抑制剂)组(EIT+AB)12耳、对照组2(C2)12耳,电极插入创伤+SP600125(JNK抑制剂)组(EIT+SP)12耳、对照组3(C3)12耳。2、采用免疫荧光技术检测术后3小时各实验组内耳听毛细胞PARP、p-JNK和AIF表达,观察其表达部位及强度。3、采用蛋白印迹技术(western blot)检测术后3小时各实验组内耳组织中听毛细胞PARP、p-JNK和AIF蛋白表达水平。结果:1、术后3小时,PARP在EIT和EIT+SP组内耳毛细胞核中明显表达,在EIT+AB组内耳毛细胞核中表达减弱。对照组均未见表达。2、术后3小时,p-JNK在EIT组内耳毛细胞核中明显表达,在EIT+AB和EIT+SP组内耳毛细胞核中表达减弱。对照组均未见表达。3、术后3小时,AIF在EIT组内耳听毛细胞中有明显的核转移表达,在EIT+AB和EIT+SP组中有轻度的核转移表达,在对照组中轻度表达于细胞核外。结论:在豚鼠电极插入创伤模型中,PARP调节AIF从线粒体向细胞核的转移,在这个过程中,JNK起了重要的作用。PARP可能通过JNK来发挥调节AIF的作用。PARP活化→JNK活化→AIF核转位通路可能介导电极插入创伤诱发的内耳听毛细胞损伤。第三部分全反式维甲酸对于电极插入创伤内耳听功能损伤保护作用目的:通过腹腔注射全反式维甲酸,观察其对于电极插入创伤后内耳毛细胞损伤以及听功能的保护作用。方法:1.豚鼠内耳电极插入创伤模型的建立和分组:建立电极插入创伤模型,分组如下:电极插入创伤+亚麻油注射组(EIT)12耳、对照组(C)12耳,电极插入创伤+全反式维甲酸注射组(ATRA)12耳.。2、听性脑干电位检查各实验组动物在术前、术后(D0)、术后第3天(D3)、术后第7天(D7)ABR阈值。3、术后第7天,各实验组动物基底膜铺片+Hoechst 33342染色,观察听毛细胞病变情况。4、术后第7天,采用免疫荧光技术观察各实验组内耳听毛细胞的p-JNK表达。结果:1、EIT组在术后即表现出ABR阈值升高,继之为进行性听功能受损。实验期间,总ABR阈值变化(D7-术前)在ATRA组为18.33±4.92dB,在EIT组为36.67±3.26dB,对照组ABR阈值没有明显变化。2、术后第7天基底膜铺片Hoechst 33342染色观察,对照组听毛细胞排列整齐,大小一致,染色均匀;EIT组和ATRA组听毛细胞表现不同程度的病理改变。外毛细胞总病变率在EIT组为(29.44±3.47)%,在ATRA组为(13.72±3.33)%,内毛细胞病变率在EIT组为(14.07±2.43)%,在ATRA组为(6.01±2.97)%。3、术后第7天,p-JNK在ATRA组内耳听毛细胞轻度阳性表达,主要位于胞核中,在EIT组内耳听毛细胞呈显著阳性表达,主要位于胞核中,对照组未见表达。结论:1、豚鼠在耳蜗电极插入后出现听力损失,其模式表现为首先出现的急性听力下降(与直接创伤有关),继之为至少持续一周的进行性发展的听力下降。2、全反式维甲酸可抑制电极插入创伤后所引发的进行性听力下降,它可能通过抑制JNK细胞损伤径路从而起到听力保护作用。