第一部分重组人血小板生成素的生殖毒性研究背景在临床出血性疾病中,原发免疫性血小板减少症(ITP)是最常见的。ITP在人群中发病率为5～10/10万。女性发病率在育龄期高于同龄男性。在妊娠早期引起血小板减少的主要原因就是。其占妊娠期血小板减少总数的3%～5%。妊娠ITP患者的血小板计数多随孕周增加进行性下降,至妊娠晚期达低谷。其中1 5%～3 5%的患者需要治疗。妊娠合并ITP患者治疗方案与非妊娠相似。一线治疗推荐糖皮质激素或静脉输注丙种球蛋白。但对于一线治疗无效的患者,二线治疗非常有限,国内外指南推荐的唯一二线方案是激素联合丙种球蛋白。最近一项重组人血小板生成素(rhTPO)用于妊娠合并ITP患者的临床试验初步证明,rhTPO可以明显升高血小板计数,且对孕产妇及胎儿/新生儿无明显毒副作用。rhTPO广泛用于妊娠合并ITP的临床治疗,仍需要系统严谨的动物生殖毒性实验。其药物安全性仍需通过动物模型研究以得到可靠的证实。因此我们进行了rhTPO的生殖和发育毒性的相关研究。研究目的1.产仔雌性小鼠生殖毒性研究——生育能力及早期胚胎发育毒性试验。2.产前发育毒性研究——胚胎-胎仔发育毒性试验。3.围产期毒性研究。研究方法1.生育能力的影响和胚胎早期发育毒性试验。雌雄小鼠各80只合笼。雌性小鼠随机分成四组:对照组和低中高剂量rhTPO组。自交配前14天至妊娠第5天(G5)每天定时皮下注射rhTPO。剂量为0 U/kg(对照组)、150 U/kg(低剂量组)、1500 U/kg(中剂量组)和15000U/kg(高剂量组)。主要观察交配前14天至G18日常活动。记录体重及进食量。G18处死孕鼠后大体解剖。主要记录除子宫体重、黄体数、着床数、活胎数、吸收胎数及性别数等。着重观察雌鼠受孕及流产状况。计算各组生育指数、植入损失率及植入后损失率。解剖流产雌鼠,分析流产原因。2.胚胎-胎仔发育毒性试验。成功交配的雌性小鼠80只随机分成四组。G6至G15皮下给予不同剂量的rhTPO,记录从G0-G18日常行为变化、体重及进食量。G18处死解剖孕鼠。记录除子宫后体重及受孕胎产流产相关数量,计算相关比率。应用解剖显微镜检查记录胎仔外观、内脏及骨骼的变异畸形。着重观察是否有弯尾、腭裂、小胸腺、鼻腔扩张、侧脑室增大、肾盂扩张、多生肋骨、颞骨不完全骨化、枕上穿孔等畸形。3.围产期毒性研究。雌性小鼠和雄性小鼠各80只合笼,雌性小鼠随机分成四组,从交配前14天至哺乳期第21天给予不同剂量rhTPO。全程观察母鼠围产期日常情况。观察分娩状况。记录幼崽活产、死产和畸形数量,解剖死亡幼崽,分析死亡原因。观察其生理状态和行为发展,着重记录幼崽发育进步的时间点,包括开眼、萌牙及相关神经发育反射(平面翻正反射、负趋地性、悬崖回避、视觉定位和听觉惊跳反射等)。研究结果1.产仔雌性小鼠生殖毒性的研究。本阶段所有实验组均未见F0雌性小鼠日常异常现象。有6只雌性小鼠分娩时因胎位不正难产死亡,其中对照组和中剂量组各1只,低剂量组和高剂量组各2只。尸检后未发现与用药有相关性。有4只小鼠未交配成功,其中对照组和低剂量组各1只,高剂量组2只。对其进行卡方检验,对照组和各剂量组之间无显著性差异(P>0.05)。随着受孕、着床及妊娠后小鼠的生理变化,各组雌性小鼠增重相当(表1.A)。在G18尸检雌性小鼠,记录除子宫后体重、黄体数、植入数、活胎数、死胎数、早期流产数、晚期流产数、胎鼠雌雄数及胎鼠体重,进行统计分析,计算植入损失率、植入后损失率及性别比例,计算平均数±标准差,采用单因素方差分析检验(one-way ANOVA test),联合 Tukey 多重比较检验(Tukey’s multiple comparisons test)结果显示各剂量组与对照组无显著性差异(P>0.05)(表1.B)。2.产前发育生殖毒性研究。F0代雌性小鼠符合妊娠期生理变化。分娩时,由于胎位不正2只小鼠难产死亡,对照组和低剂量组各1只,小鼠进食量和增重各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)(表2.A)。在G18处死孕鼠,对其尸检,所实验小鼠均交配受孕成功,交配指数100%。记录除子宫后体重、黄体数、植入数、活胎数、死胎数、早期流产数、晚期流产数及雌雄数,计算平均数±标准差后,统计学分析示各记录项目在四组间无显著性差异(P>0.05)。计算植入损失率、植入后损失率及性别比,各组间亦无显著性差异(P>0.05)(表2.B)。对胎鼠进行畸形学检测,采用Kruskal-Wallis检验(Kruskal-Wallis test)联合Dunn多重比较检验(Dunn’s multiple comparisons test),对照组与各剂量组之间在活胎数量及胎鼠体重比较差异无统计学意义(P>0.05)。对外观、内脏和骨骼的畸形变异的观察显示:中剂量组出现1只小胸腺畸形,发生率在胎鼠生长发育畸形的正常范围(P>0.05)。4只胎鼠出现多生肋骨,其中对照组1窝2只,中高剂量组各有1只,1只低剂量组发生颞骨不完全骨化,上述畸形的发生率,在胚胎正常发育范围内,与用药无关,对照组与各剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。未观察到其他系统的畸形变异(表2.C)。3.围产期生殖毒性研究。在本阶段研究中,仍存在因胎位不正难产死亡的孕鼠,对照组与中剂量组各1只,经卡方检验,分析与用药无关,是分娩的正常不良现象。比较各组产仔雌鼠和幼崽的体重亦无显著性差异(P>0.05)(表3.A)。对子代小鼠的观察研究中发现,各组幼崽死产数相当,无显著性差异(P>0.05)。在哺乳期阶段,各组幼崽都有死亡现象,计算存活指数,各剂量组与对照组比例相当,无显著性差异(P>0.05)。存活幼崽在哺乳期增重正常,仔细观察重点发育现象出现的时间点,各组间无显著性差异(P>0.05)(表3.B)。结论综上所述,三种不同药物剂量组的小鼠在交配、受孕、胚胎着床、胚胎发育、分娩、哺乳等各阶段的大体外观、尸检后观察脏器、胚胎、胎仔发育及子代成长的各项指标的观察研究中,与对照组比较差异无统计学意义。在本研究条件下,rhTPO对小鼠的雌性生殖力及胚胎发育、分娩、哺乳的无不良反应剂量(NOAEL)为 15000U/kg/day。意义rhTPO用于雌性小鼠的生殖功能无不良反应,为临床上用于妊娠合并ITP患者的治疗提供实验依据支持。第二部分rhTPO对妊娠合并ITP模型小鼠Tregs的影响及相关机制研究背景促血小板生成素(TPO)是一种内源性蛋白激酶,通过结合巨核细胞膜上的c-Mp1受体,进而激活巨核细胞上的JAK/STAT、Ras/MAPK等信号通路,来诱导酪氨酸磷酸化,从而刺激巨核祖细胞增殖、分化、成熟。TPO在巨核细胞生成的各个阶段调节血小板的生成,增加血小板的数量,缓解由于各种原因所致的血小板减少。重组人血小板生成素(rhTPO)已在临床广泛应用于ITP二线治疗及化疗相关的血小板减少的治疗。本课题前期研究发现rhTPO治疗ITP妊娠小鼠模型有效,对小鼠妊娠及围产期无明显不良作用。进一步检测rhTPO治疗前后调节性T淋巴细胞(Tregs)的比例及转化生长因子-β(TGF-β)的水平,证明rhTPO可以有效提升TGF-β水平,提高Tregs比例。但对于rhTPO与Tregs和TGF-β的作用关系尚不清楚,本研究着重探究rhTPO的作用机制与Tregs和TGF-β的关系,以进一步探索rhTPO用于治疗ITP的免疫调节机制。研究目的1.妊娠合并ITP小鼠模型的建立,检测其稳定性。流式细胞术检测脾脏单细胞悬液全淋巴细胞中CD4+T细胞与TPO配体c-Mβ1的表达。研究T细胞表面是否存在的TPO的结合位点,即rhTPO是否可直接作用于T淋巴细胞。2.进一步验证TPO免疫调节中Tregs和TGF-β的关系。应用流式细胞术检测妊娠ITP小鼠脾脏单细胞悬液CD4+T细胞中Tregs的比例,口服TGF-β受体抑制剂(LY2109761)后皮下注射rhTPO治疗后Tregs 比例变化,探究Tregs和TGF-β的作用关系。3.建立条件敲除血小板表面TGF-β的基因ITP小鼠模型,检测rhTPO对外周血小板计数、Tregs比例及TGF-β水平的影响,探究rhTPO对Tregs的作用机制。研究方法1.被动妊娠合并ITP小鼠稳定模型建立。根据本课题前期试验的相关研究经验和方法,雌雄比2:1合笼至确认妊娠,尾静脉注射抗CD41抗体(MWReg30)5μg/200μL/只,确认妊娠合并ITP模型鼠成功建立。四组剂量rhTPO治疗模型鼠后,检测外周血小板计数证明rhTPO治疗效果。2.血小板(PF4-Cre)特异性TGF-β敲除小鼠的繁育,以建立被动性条件性TGF-β基因敲除ITP小鼠模型。建模前后小鼠外周血小板计数检测比较,确定建模情况。3.妊娠合并ITP模型小鼠在妊娠结束留取外周血后处死,解剖出脾脏,网筛研磨法提取脾脏单细胞悬液。利用流式细胞术检测脾脏CD4+T细胞与TPO配体c-Mpl的表达。4.CD4+免疫磁珠法分选出妊娠合并ITP模型小鼠脾脏CD4+T细胞,用0μg/L和2μg/L的rhTPO培养3天,应用流式细胞术检测体外rhTPO治疗后,脾脏CD4+T细胞中Tregs的比例差异。5.妊娠合并ITP小鼠模型20只,随机分成两组。实验组口服100mg/kg TGF-β受体抑制剂(LY2109761),对照组口服相同体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液,共14天。从第1天开始,同时给两组小鼠皮下注射1500U/kg rhTPO 14天后,处死所有模型小鼠。检测血小板计数。6.流式细胞术检测上一步rhTPO治疗妊娠合并ITP小鼠模型脾脏CD4+T细胞中Tregs比例。7.被动条件性TGF-β基因敲除ITP小鼠模型皮下注射rhTPO 15000U/Kg/day,治疗14天后处死小鼠,留鼠尾血,制备脾脏单细胞悬液。检测外周血小板计数。Elisa法检测血清中TGF-β1水平。流式细胞术检测单细胞悬液中Tregs比例。研究结果1.成功建立妊娠合并ITP模型小鼠。2.四组剂量rhTPO治疗ITP孕鼠后,低中高剂量组血小板计数明显高于对照组。3.建立被动条件性TGF-β基因敲除ITP小鼠模型成功。被动条件性TGF-β基因敲除ITP模型组和flox ITP对照组外周血小板计数在注射抗体24h后均明显下降。直至第14天,血小板计数仍均低于建模前。两组间对比无显著性差异。4.TGF-β基因敲除模型鼠rhTPO治疗组血浆TGF-β1水平明显低于未行基因敲除ITP模型rhTPO治疗组(P=0.040)。5.流式细胞术结果分析显示,ITP孕鼠脾脏单细胞悬液全淋巴细胞中CD4+T细胞与c-Mpl无共表达,提示全淋巴细胞中CD4+T细胞表面c-Mpl呈阴性。rhTPO不能直接作用于CD4+T细胞。6.体外试验,rhTPO培养ITP孕鼠脾脏淋巴细胞组与对照组,CD4+/CD25hi/Foxp3+Tregs细胞占CD4+T细胞比例无显著性差异(P=0.619)。7.rhTPO升高血小板计数不需要TGF-β参与7.1妊娠合并ITP模型鼠rhTPO治疗过程中,加用TGF-β受体抑制剂与单纯rhTPO治疗对照组小鼠外周血血小板计数。两组间对比无显著性差异(P=0.347)。7.2 TGF-β基因敲除ITP模型鼠rhTPO治疗组与未行基因敲除ITP模型rhTPO治疗组血小板计数均有回升,且无显著性差异(P=0.685)。8.Tregs 比例升高与TGF-β水平升高有关8.1妊娠合并ITP模型鼠rhTPO治疗过程中,口服TGF-β受体抑制剂小鼠脾脏CD4+T细胞中Tregs 比例明显低于单纯rhTPO治疗ITP孕鼠模型组(P=0.044)。8.2 TGF-β基因敲除ITP模型鼠rhTPO治疗组脾脏CD4+T细胞Tregs 比例与未行基因敲除ITP模型rhTPO治疗组相比明显减低(P=0.040)。结论通过对ITP发病机制研究发现,由抗血小板抗体介导的ITP的发病过程,在一定程度上能够被妊娠ITP小鼠模型所重复。rhTPO被推荐为原发免疫性血小板减少症治疗的二线药物,不能直接作用于CD4+T细胞,而是通过c-Mpl作用于巨核细胞表面,刺激巨核细胞活化产生血小板,血小板释放TGF-β1增加,进而提高Tregs在CD4+T细胞中比例,发挥调节免疫作用。意义重组人血小板生成素用于治疗妊娠合并ITP小鼠模型升血小板计数疗效确切。rhTPO主要通过与巨核细胞表面受体c-Mpl结合,促进巨核细胞活化增生,提高血小板计数,增升的血小板促进释放TGF-β1,进一步提高Tregs在T细胞中比例,促进ITP患者长期缓解诱导免疫耐受提供有效理论依据。