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第一部分:LRG1在结直肠癌组织中的表达及其临床意义目的:研究LRG1在结直肠癌组织和正常组织中的表达水平,探讨LRG1蛋白在结直肠癌组织中的表达与哪些临床病理因素相关。方法:利用公共数据库中的芯片数据分析LRG1在结直肠癌组织和正常肠黏膜中的表达情况。收集30对新鲜结直肠癌组织和癌旁正常组织标本,通过Real-time PCR检测组织标本中LRG1 mRNA的表达水平。免疫组化实验评估68例结直肠癌组织和32例正常肠黏膜组织的石蜡标本中LRG1蛋白的表达情况,分析68例结直肠癌组织中LRG1的阳性表达与患者临床病理因素之间有无相关性。结果:1、选择Oncomine数据库中的两个芯片数据集GSE20916和GSE20842,芯片数据分析显示LRG1在结直肠癌组织中的表达量显著高于正常组织。2、Real-time PCR结果显示LRG1在30对新鲜结直肠癌组织中的表达水平显著高于配对的正常组织(P<0.0001)。3、免疫组化实验发现LRG1蛋白在结直肠癌组织中的阳性率为66.18%(45/68),在正常组织中的阳性率为31.25%(12/32),差异具有统计学意义(P=0.007)。LRG1的表达与结直肠癌的T分期和N分期具有相关性,T3/T4期结直肠癌组织中LRG1表达阳性率显著高于T1/T2期结直肠癌(P=0.032),淋巴结转移阳性患者的LRG1表达阳性率显著高于淋巴结阴性的患者(P=0.013)。结论:LRG1在结直肠癌中的表达水平显著高于正常肠黏膜组织,且与结直肠癌的浸润深度和淋巴结转移情况呈正相关。因此推测,LRG1可能在结直肠癌的发生发展,尤其是侵袭转移过程中发挥重要作用。第二部分:LRG1对结直肠癌细胞生物学行为的影响目的:研究LRG1对结直肠癌细胞迁移、侵袭能力的作用,以及对上皮间质转化表型的作用。探讨LRG1刺激结直肠癌细胞对其VEGF-A表达水平的影响,以及结直肠癌细胞来源条件培养基对血管内皮细胞生物学行为的影响。方法:将LRG1 siRNA和阴性对照siRNA转染到两种结直肠癌细胞系 HCT116 和 SW480 后,通过 Real-time PCR 和 Western blot 验证LRG1 siRNA的干扰效率。划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测转染LRG1 siRNA后HCT116和SW480细胞的迁移和侵袭能力。利用 Real-time PCR 和 Western blot 检测上皮细胞标志物(E-cadherin,VDR),间质细胞标志物(N-cadherin,Vimentin,α-SMA)和 EMT 相关转录因子(Twist1)的表达水平,评估敲除LRG1对结直肠癌细胞上皮间质转化表型的作用。不同浓度和时间梯度的人重组LRG1蛋白刺激HCT116和SW480细胞后,Real-time PCR检测细胞中VEGF-A mRNA的表达水平,ELISA检测细胞培养上清中VEGF-A蛋白的含量。收集经人重组LRG1蛋白刺激HCT116细胞的条件培养基,用于人脐静脉内皮细胞迁移实验和小管形成实验,评估不同处理组肿瘤细胞来源条件培养基对血管内皮细胞迁移能力和小管形成能力的影响。结果:1、LRG1 siRNA能够显著下调HCT116和SW480细胞中LRG1 mRNA和蛋白的表达水平。划痕实验中,LRG1 siRNA干扰组细胞的伤口愈合速度明显比阴性对照组慢。LRG1 siRNA干扰组穿过 Matrige1 胶的细胞数明显减少。2、Rea1-time PCR 和 Western blot结果显示,结直肠癌细胞中干扰LRG1导致上皮细胞标志物E-cadherin和VDR的表达明显上调,间质细胞标志物N-cadherin,Vimentin,α-SMA和转录因子Twist1的表达均明显下调。3、人重组LRG1蛋白刺激HCT116和SW480细胞后,VEGF-A mRNA和蛋白分泌水平均出现上调,且具有时间和浓度依赖性。LRG1刺激HCT116细胞后的条件培养基能使内皮细胞迁移速度明显加快,小管形成数量显著增多。结论:干扰LRG1基因能抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力,逆转上皮细胞向间质细胞的表型转化过程。LRG1刺激结直肠癌细胞能显著上调VEGF-A mRNA的表达和蛋白的分泌,影响肿瘤局部的血管生成。第三部分:LRG1促进结直肠癌侵袭转移的机制研究目的:LRG1促进结直肠癌细胞迁移侵袭和肿瘤血管生成的作用机制尚不明确。本部分将探索LRG1的下游基因和参与的信号通路。验证LRG1诱导结直肠癌细胞发生EMT和过表达VEGF-A是否依赖于 HIF-1α。方法:利用人基因表达谱芯片技术筛选SW480细胞转染LRG1 siRNA和阴性对照siRNA组下游差异表达的基因,对数据进行分析后最终选定HIF-1α。为进一步验证LRG1和HIF-1α的关系,我们用不同浓度的人重组LRG1蛋白刺激结直肠癌细胞后,分别用Real-time PCR 和 Western blot 检测 HIF-1α mRNA 和蛋白表达水平。预先干扰HIF-1α的表达后,再加入LRG1刺激SW480细胞,用ELISA检测细胞培养液中VEGF-A的分泌水平,Western blot检测HIF-1αu VEGF-A、N-cadherin、E-cadherin 和 Twist1 的表达量,Transwell 侵袭实验检测细胞的侵袭能力。结果:基因芯片检测结果显示LRG1与多条肿瘤相关的通路有关联。LRG1刺激结直肠癌细胞后,HIF-1α mRNA和蛋白表达水平均随着LRG1刺激浓度的增加而显著升高。沉默HIF-1α显著抑制了 LRG1促进的VEGF-A蛋白分泌,逆转了 LRG1诱导的EMT表型,降低了SW480细胞的侵袭能力。结论:LRG1能够上调结直肠癌细胞中HIF-1α mRNA和蛋白的表达。HIF-1α介导了 LRG1诱导的VEGF-A过表达和EMT表型。