双孢蘑菇POD的提取、纯化及特性测定

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过氧化物酶(peroxidase,POD)在果蔬中普遍存在,能催化许多反应的进行,种类繁多,通常也不会被其他酶所抑制,POD对于果蔬的采后贮藏褐变有极为重要影响。对菇体无机械损伤、未开伞的双孢蘑菇进行试验,经过匀浆抽提,固体硫酸铵分级沉淀,分别选用20%和80%饱和度的硫酸铵对双孢蘑菇POD粗酶液进行盐析得到粗提的酶液。将粗酶液进行DEAE-Cellulose-52阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析,最终获得了双孢蘑菇POD的电泳纯品,其相对分子质量为74.08KDa,该酶比活力达到426.69U/mg,纯化倍数为66.77,回收率为13.41%。以愈创木酚为底物对初步纯化的双孢蘑菇POD的酶学特性进行了分析,测得米氏常数Km为5.704mmol/L,表明双孢蘑菇POD与愈创木酚的亲和力较好。当H2O2浓度为0.8%时POD活性达到最大。POD的最适反应p H为5.0,最适反应温度为45°C,在30-50°C之间,保温5h内均具有良好的热稳定性,说明POD的耐热性比较强。七种化合物对双孢蘑菇过氧化物酶活性的抑制效果由强到弱依次为:DTT>ASA>L-Cys>SDS>无水亚硫酸钠>柠檬酸>Na Cl。分别采用低温贮藏、保鲜剂和气调处理双孢蘑菇,并对其在贮藏期间的POD活性、菇体中心和菇肉的白度变化进行了对比,结果表明:气调贮藏双孢蘑菇的POD酶活性最低,但抑制剂处理的白度值最高,说明POD不是导致双孢蘑菇褐变的直接原因。采用不同温度贮藏双孢蘑菇时,在2°C和10°C贮藏时,POD活性始终保持在较低的水平,这与POD酶学特性的结果保持了一致,但在20°C贮藏时,POD活性变化显著,而且菇体中心和菇肉的白度值总体上随着贮藏时间的延长而逐步下降。
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